蛋白抗体标记

说到抗体标记，我们首先提一个广义的概念:蛋白质标记；蛋白标记应该分为结合（Binding）和偶联（Conjugation），结合又分为特异性结合(specific binding)和非特异性结合(non-specific binding)，非特异性结合在百度百科上的定义是：某种配体与其相对应的特异性结构位点外其他无关物质(如非特异性蛋白质、容器、分离材料等)的结合，其特点是亲和力低而结合容量大。非特异性结合比较典型的例子是胶体金标记，胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程，吸附机理是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合；另外，非特异性结合比较典型的例子是ELISA实验过程中的包被步骤。非特异性结合无处不在，ELISA实验中经常遇到的非特异性反应，常常是由于内源如风湿因子,补体,高浓度非特异性免疫球蛋白,异嗜性抗体等引起的；在不同的pH和离子环境下，非特异性反应情况完全不同，这也是阴离子和阳离子纯化的基本原理。特异性结合，指若干具有化学特性或者生物特性的有机官能团，通过高度专一而高效的连接方式结合在一起，并对外显示生理活性或理化性质。常见的就是我们常用的蛋白纯化的标签，6His标签，GST标签，MBP标签，Strep标签等，还有生物素（biotin）与链霉亲和素(Streptavidin)，凝集素与糖蛋白;其中生物素与链霉亲和素其解离常数Kd≈10⁻¹⁴ mol/L，甚至高于抗原-抗体；特异性结合最大的案例群为抗原与抗体，所有的抗体公司所孜孜不倦苦苦上下求索追求的抗体，无非就是要找到与抗原特异性结合的特异性结合试剂（Specific Binding Reagent），所以这里也就总结出来，特异性结合的特点是专一性，排他性和高效性。

结合就相当于绑在在一起或者磁铁吸附在一起，结合力强弱取决于磁力大小，那么偶联就是焊接在一起，变成一个分子；不言而喻，偶联的牢固程度和稳定性要比结合强很多，况且结合的物质在溶液中是处于一个动态的解离和结合平衡过程。蛋白质偶联的共价偶联常用的是氨基（-NH2）与羧基（-COOH），但是-NH2的“人缘”更好一点，现实中应用比较多。关于蛋白质偶联和药物方面的偶联相对比较复杂，会用到更复杂的多步骤程序，这里不做赘述。

抗体的标记一般是用于药物开发和免疫检测用途；用于免疫检测用途的抗体标记从标记物上来说，大体上分为酶类和荧光素（或荧光蛋白）；酶类标记物最为常见的是辣根过氧化物酶（HRP），其次是碱性磷酸酶（AP），其他的如β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。

1.抗体的蛋白酶类或荧光蛋白标记

酶属于蛋白质，其标记到抗体上，利用其与抗体表面暴露的伯氨基（-NH₂）进行标记，最简单最粗暴的标记方法是用戊二醛进行偶联，这种标记效率低，品质控制难度比较大，其中含有大量的酶自联或者抗体自联，但是对于简单的科研测试，这个标记手段无疑是最简单快捷的。

除了粗暴的戊二醛标记法，当然也有通过交联剂间接标记的，将两个需要偶联（标记）的蛋白(抗体和标记酶)，其中一个蛋白的-NH₂位点上修饰为可与-SH反应的集团，另一个蛋白在伯氨基（-NH₂）上修饰成-SH，两个蛋白修饰后进行偶联，可以实现两个蛋白的定向偶联，如果是抗体和酶进行偶联的话，不会出现抗体自联和酶自联的情况。这种偶联的方法被用于多肽与蛋白载体（如KLH，OVA或BSA）的偶联，载体蛋白经过修饰成可以与-SH反应的基团，如-NHS基团，所用的修饰试剂，比如MBS（m-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯）,多肽在合成的时候已经在C-端或者N-端预先合成一个半胱氨酸（-Cys）接头，被修饰的蛋白载体与这个半胱氨酸（-Cys）的-SH顺利对接。说到底，这个方法还是要利用蛋白表面暴露的氨基（-NH₂）。我们在实践过程中经常会被问：这个蛋白中含有10个赖氨酸，应该可以有10个-HN₂位点被标记，其实这个是个误区，蛋白经过折叠后可暴露的可用-NH₂没有这么多。

这里有个例外，因HRP分子表面含有很多糖基团，可以利用氧化的方法使其变成醛基，醛基在酸性的情况下稳定的，在遇到抗体的时候将反应条件变换成碱性，醛基与抗体分子的伯氨基，发生醛胺缩合反应：带醛基的HRP与带氨基的抗体通过醛基与伯氨基缩合成希夫碱而进行共价交联，这就是经典的过碘酸钠氧化标记法，但是这个方法对于普通实验者来说并不友好，原因主要有以下几点：1.市面上的HRP太多，五花八门，怎么去选择合适的酶，RZ值和活性值（比如，>250U/mg）怎么看？当然是选择RZ高的，活性单位高的，但是这个价格也会高，而往往实验步骤上体现的又是mg，买到的酶偏偏是IU标注，怎么换算？2.过程控制很重要，抗体标记的过程中HRP氧化的问题，养化产物是很不稳定，我们做过测试氧化超过30分钟，HRP很容易沉淀和失活，如果不立即用于抗体标记，存放过程HRP中逐渐聚集或者失活，这样标记效率很低，或者说标记了很多的失活HRP到抗体上，显示抗体效价很低；另外，抗体标记过程中的酶与抗体的量比例的问题，如果比例不对的话会造成两个极端的结果：标记效率太低或者标记后的抗体用于实验中背景太高。3.标记完以后，抗体标记物的保存问题，这个是个很大的问题，不正确保存的话，抗体一周内基本就会失活。所以对于初学者，实验室不是非要建立这个标记的技术平台的话建议买HRP抗体标记试剂盒。

说到HRP标记试剂盒，我们可能会认为买了试剂盒之后就可以实现无忧标记了，其实不然，试剂盒只是优化了很多条件，使标记实验的风险降到最低。任何实验都需要在实验前认真阅读说明书，对流程非常熟悉，特别忌讳的是说明书都没有认真阅读，拿到试剂盒就看一步做一步，需要提前准备的材料都没有准备，这样手忙脚乱的做，操作不能一气呵成，实验的最佳时机往往错过了，甚至对步骤的理解错了，实验结果肯定不会理想。不管是用试剂盒还是自己标记，用于标记的抗体 一定要符合标准，一定要按照说明书的要求进行，抗体纯化不好，抗体浓度测试不准，抗体溶液环境不对，这些都严重影响标记效果；简单讲一下原理，如果抗体浓度不准，你所计算的HRP与抗体配比肯定与实际不符了，标记比例不对；如果抗体纯度不够，杂质会干扰标记，很多杂质占用了HRP，造成目标抗体标记不足，这些被标记的杂质，在后期实验过程中又会产生大量的假信号。抗体的纯化通常就是那么几种：硫酸铵沉淀，ProteinA/G特异性亲和纯化，后期一般是通过透析或者脱盐置换缓冲液至PBS环境，教科书上纯化实验过程可能不会强调透析这个步骤的重要性，或者只是简单告诉你透析几次，多少时间换液一次，我们仔细思考一下这个问题：我们透析液的体积是多少?透析袋里面的液体体积是多少？需要多少小时透析袋内外溶液离子浓度通过自由扩散才能保持一致？假如说在磁力搅拌器搅拌的情况下，3小时透析袋内外离子浓度扩散到一致，透析袋内液体1ml,透析液200ml, ProteinA/G特异性亲和纯化的过程，用洗脱液（0.1M Gly-HCl，pH2.7）洗脱和中和缓冲液（0.5M Tris-Cl，pH8.0）中和，此时抗体溶液的中甘氨酸和Tris浓度很高，-NH₂总浓度达到0.3M左右，我们每次透析稀释200倍，四次透析后稀释了1.9*10^-4uM,1mg/ml的抗体的浓度为6.67*10^-3uM，抗体是-NH2浓度的35倍，这样的抗体，基本不影响标记。但前提是以上的透析必须充分透彻，有时候我们为了省事，把几个抗体放在一个透析缸里进行透析，透析就是不充分了。那么我们如何解决这个问题呢，在透析的时候可以试着加一点不会对抗体、HRP和标记过程有影响的示踪剂，这个示踪剂的浓度是-NH₂总浓度的数倍，这个倍数的确定方法：肉眼可见颜色的示踪剂最低浓度乘以达到理想离子去除浓度所应该透析的倍数，最后确定示踪剂加入的浓度。

     蛋白类荧光的标记，基本上习惯于利用交联剂进行间接定向标记的技术路线。最常见的可用于标记的荧光蛋白主要有藻红蛋白（R-PE）和别藻蓝蛋白(APC),还有一个多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物（PerCP）比较少用。福因德经过数年测试，研发出了藻红蛋白（R-PE）-抗体标记试剂盒和别藻蓝蛋白(APC)-抗体标记试剂盒，可以大大节约科研工作者的标记摸索时间，同时取得比较好的实验效果。

2.化学小分子标记物（荧光素标记物）的标记；

这类小分子的标记的目标基团还是蛋白或者抗体表面暴露的-NH₂，荧光素经过修饰，其衍生物上含有可以与-NH₂反应的活性官能团，当然为了适应不同的标记反应需求，可以在荧光素的修饰不同的官能团，以适应与抗体不同的官能团对接偶联需求。这类小分子的标记的核心是设计出最好的标记策略和标记条件优化，这是两个难点，福因德经多年的技术摸索，摸索出最优化的标记条件，对于最令人头疼的摩尔浓度计算的问题，我们开发出在线标记计算小工具，轻松实现计算，再也不会因为计算出错而影响标记效果了。目前，我们可以提供的荧光素试剂盒有如下种类：Frdbio® 荧光素Cy3, Frdbio® 荧光素Cy5, Frdbio®FITC, Frdbio®荧光素Flour350, Frdbio®荧光素Flour405, Frdbio®荧光素Flour488, Frdbio®荧光素Flour555, Frdbio®荧光素Flour590, Frdbio®荧光素Flour594, Frdbio®荧光素Flour647, Frdbio®荧光素Flour680, Frdbio®荧光素Flour750, Frdbio®荧光素Flour770.

这里要特别说说关于生物素（biotin）的标记，与上述小分子荧光素的标记原理基本相同，生物素标记配合链霉亲和素作为目前应用最为广泛的一种免疫学检测放大手段和工具。福因德研发团队在传统的长臂生物素标记试剂基础上，设计出标记效率最为友好的生物素结构，主要优点：1.标记效率提高3-5倍，2.是标记产物的稳定性更好，3.对抗体或者被标记蛋白结构影响最小。在此技术支持下的超级生物素标记试剂盒，或许能够解决您的免疫系统林敏度问题。经过生物素标记的抗体或者蛋白产物，究竟其标记效果如何？福因德开发出了相应的配套检测计算试剂盒(HABA法生物素标记效率检测试剂盒)，让实验者轻松实现标记效果检测，实验效果更好，实验逻辑思路更严谨。生物素与链霉亲和素是一个免疫学实验经典组合，鉴于生物素和链霉亲和素强大的结合能力，其可以使免疫学信号放大几十倍甚至上百倍，由于这套系统超高的灵敏度，所以对于链霉亲和素酶标记复合物的要求也很高，不但要特异性结合能力强，而且还要非特异性结合最少，链霉亲和素酶复合物中应用最多的是链霉亲和素-HRP，除此以外还是有各种荧光素结合复合物，如FITC-链霉亲和素，Fluor488-链霉亲和素，等等，需要更多的荧光素标记链霉亲和素，请联系我们。

3.酶催化标记

酶催化主要是针对重组蛋白的标记的，最为经典的是在生物素连接酶(Biotin Ligase,BirA)的催化下，对含有AviTag标签多肽进行特异性标记的，AviTag标签多肽是一个15个氨基酸的短肽（GLNDIFEAQKIEWHE），标记过程可以在重组蛋白表达的同时进行，也可以后期在宿主体外实验进行，对重组蛋白进行特异性定点标记，可以方便蛋白通过Streptavidin填料进行特异性纯化，这对于解决其他标签无法纯化，效果不佳的问题，提供新的解决方案和途径。经过生物素标记的蛋白可以更方便用于进行下游的免疫学实验。关于通过生物标记途径进行蛋白纯化的整体方案，可以与我们技术部门沟通，这套体系包括从载体设计，到蛋白的生物素标记，再到Streptavidin填料纯化，以及可能涉及到的蛋白酶切割，我们都可以提供整套解决方案，在此遇到困难的小伙伴可以与我们联系解决。

4.特异性结合与非特异性结合标记

上文已经提到了一些，特异性结合最经典应用最多的就是生物素-链霉亲和素（亲和素系统），这里有个经典的试剂，SABC试剂，先用生物素标记HRP，让后将生物素标记的HRP与链霉亲和素（亲和素）按照特定比例混合，一个亲和素上有4个生物素结合位点，只要生物素的位点不被生物素不被饱和覆盖（最好是被生物HRP结合是三个位点），空余一个位点，这样最利于生物化标记抗体的下游配套试剂使用，生物素标记的抗体的一个生物素位点可以衍生出三个HRP分子，信号瞬间放大3倍以上，比HRP直接标记抗体性能好很多倍，当然这个是理想状态，实际实验中需要实现高效能需要不断的优化摸索。

非特异性标记的经典用途是胶体金标记，这里不做赘述，需要了解相关信息，请关注我们的官方网站，我们将不定期推出非常接地气的技术方面的原创文章。

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