实验前准备：

1.仔细阅读使用说明书。

2.提前20min 从冰箱中取出试剂盒，使试剂盒各组分平衡至室温；

3.用FITC助溶剂（DMSO，使用前需要放在室温融化）溶解FITC。

 特别提示：

A.溶解的活好FITC最好一次性使用完，如果使用不完可以密封放在-20℃的冰箱内，一周内可以使用，但是标记效率会降低；

B.FITC助溶剂使用完之后需要立即密封保存，防止吸潮。

操作步骤：（本操作步骤按照 1mg抗体的量进行标记）

1.取1mg 待标记抗体于超滤管中，并加入不超过超滤管最大体积的标记缓冲液， 12,000 g 离心 10min；可以重复此步骤多次；最后一次超滤完成，可以加入适量标记缓冲液调整抗体的浓度到2mg/mL左右；

A.超滤管的最大体积和最大截留分子量，本实例超滤管的最大体积为 0.5mL；

B.如果待标记抗体浓度低时，可先超滤离心浓缩；

C.如果待标记物含有游离的氨基（Tris,氨基酸或者其他干扰物，需要用标记缓冲液反复超滤确保其去除干净）。

2.加入溶解的FITC 50µL至上述超滤管中，并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育 60min以上；

3.标记结束以后加入 1/10体积的FITC清除指示剂至上述超滤管中；

4.12,000g 离心 10min；

5.加入适量标记缓冲液至上述超滤管中，并轻轻吹打混匀，12,000g 离心 10min。并重复操作多次，直至超滤管中没有蓝色，未标记的FITC被彻底清除干净；收集超滤管中的溶液，即为FITC标记抗体。

标记偶联比率的计算:

C是某个蛋白的一个常数；

MW是蛋白的分子量；

389是FITC的分子量；

195是偶联的FITC在490nm（PH13.0）情况下1mg/ml的吸光值；

A495是已标记物在495nm情况下的吸光值；

A280是已标记物在280nm情况下的吸光值，此吸光值应在0.2-1.4之间，如果超出这个范围需要稀释后再测值；

(0.35 X A495)是FITC在280nm情况下吸光值的校正系数；

E0.1% 是1.0 mg/ml的蛋白在280nm的吸光值。

选购之前客户需要根据待标记物的分子量大小和标记量选择最适宜的型号

注意事项：

1.本试剂盒适用于所有含有ε-氨基（NH2-）的大分子物质的标记，（蛋白，抗体，以及其他含有伯氨基（NH2-）的化合物分子），具体标记比例根据待标记物中氨基的数量确定；

2. 本试剂盒中的FITC助溶剂为DMSO ，使用完毕后要密封干燥保存；

3. 本试剂盒配备了标记物保存液，实验人员也可以根据被标记物的特点不同，选择更适合的保存液。

4. 本试剂盒未开封前的有效期为18个月，请在有效期内使用。

5. 本系列试剂盒提供的为超滤管分为不同的截留分子量和不同的最大容积，客户需要根据自己要标记的物质的分子量大小和标记量选择适合的型号；

*本试剂仅供实验室研究使用