产品介绍:
2-(4-羟基苯偶氮)苯甲酸(2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid ,英文缩写HABA)可以与亲和素特异性结合,其结合复合物为一种黄色或者橘黄色,在500nm有最大吸光值;但是其结合力远远低于生物素与亲和素的结合,当溶液中存在生物素的时候,生物素会强竞争让HABA解离下来,引起吸光值下降。基于此原理,可以根据500nm吸光值的变化计算出蛋白标记生物素的量(被标记蛋白与生物素的摩尔比)。
生物素标记摩尔比的计算是基于比尔-朗伯定律(Beer–Lambert law),又称比尔定律或比耳定律(Beer's law),是分光光度法的基本定律,即当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度(Absorbance,A)与吸光物质的浓度(Consenreation,C)及吸收层厚度(length,L)成正比, 用公式表示为:A = ε*C* L其中A为光度,ε为摩尔吸光系数,所以此处公式为A 500= ε500 C L(此处ε500=34,000M-1cm-1)
主要组分:
组分名称(Components) | 规格 | 组分说明 |
HABA- Avidin混合液(干粉) | 1VL | 临用前加ddH2O 定容到10ml |
PBS(pH7.2) | 30ml | 100mM 磷酸钠,150mM NaCl |
储存条件:
该试剂盒在低温下运输,收到后请置于2-8℃保存,保存时间2年以上。
实验操作可以选择分光光度法或微孔酶标板法:
分光光度法:
A. 取900uL HABA- Avidin混合液放入1cm光程比色杯,在500nm波长测量吸光值,记录为A500(H-A);最好测量三次取平均值;
B. 在比色杯中加入100uL待测的生物素标记蛋白(Biotinylated Protein,简称BP),充分混匀后,在500nm波长测量吸光值,吸光值稳定20秒以上,记录为A500(H-A-BP);最好测量三次取平均值;如果A500(H-A-BP)<0.35,请用PBS稀释待测样品,再次重复此步骤。
微孔酶标板法:
A. 取180uL HABA- Avidin混合液放入微孔板中,在500nm波长测量吸光值,记录为A500(H-A);最好测量三次取平均值;
B. 在微孔板中加入20uL待测的生物素标记蛋白(Biotinylated Protein,简称BP),震荡或移液器吹打充分混匀后,在500nm波长测量吸光值,吸光值稳定20秒以上,记录为A500(H-A-BP);最好测量三次取平均值;如果A500(H-A-BP)< 0.3*A500(H-A),请用PBS稀释待测样品,再次重复此步骤。
案例演示:
以Frdbio超级生物标记试剂盒(货号:ARL0021SK)标记Anti-Covid-19 Spike Mab (货号:nCoV-S-hMab-B),标记后测算标记比,分光光度计法。
本案例中被标记蛋白为抗体,分子量(MW)为150,000,浓度为5.0mg/mL,A500(H-A)=1.090,A500(H-A-BP)=0.585,
抗体摩尔浓度计算:mM /mL=5/150000=3.33*10-5
ΔA500=(0.9*1.090)- 0.585=0.396
生物素摩尔浓度计算:mM /mL=0.396/(34000*1)=1.16*10-5
抗体:生物素(摩尔比)=(3.33*10-5)/(1.16*10-5*10)=1:3.48
常见问题解答:
问:说明书中的两种测量方法,分光光度计法和酶标仪法,哪种更好?
答:如果实验室条件允许,优先选择分光光度计法,因为标准的分光光度计测量的光程为10mm,而酶标仪法测量的光程很短,(液面高度只有6mm左右),并且受液体表面张力的影响,液面高度差很大,导致测量误差会偏大。所以我们建议尽可能用分光光度计法。