实验前准备：

1.仔细阅读使用说明书。

2.按照生物素标记使用量的计算的公式计算所需要的生物素的量。

3.提前 20min 从冰箱中取出试剂盒，使试剂盒各组分平衡至室温。

4.用助溶剂DMSO将活性超级生物素配制成10mM(2mg超级生物素加DMSO 440ul) 

 特别提示：

A.       溶解的活性生物素最好一次性使用完，如果使用不完可以密封放在-20℃的冰箱内，一月内可以使用，但是标记效率会降低；

B.       生物素助溶剂使用完之后需要立即密封保存，防止吸潮。

操作步骤：（本操作步骤按照 1mg抗体的量进行标记）

1.取1mg 待标记抗体于超滤管中，并加入不超过超滤管最大体积的标记缓冲液，12,000g 离心 10min；可以重复此步骤多次；最后一次超滤完成，可以加入适量标记缓冲液调整抗体的浓度到2mg/mL左右；

请注意：

A.超滤管的最大体积和最大截留分子量，本实例超滤管的最大体积为 0.5mL；

B.如果待标记抗体浓度低时，可先超滤离心浓缩；

C.如果待标记物含有游离的氨基（Tris,氨基酸或者其他干扰物，需要用标记缓冲液反复超滤确保其去除干净）

2. 加入13.3µL溶解的活性超级生物素至上述超滤管中，并轻轻吹打混匀。放入 37℃恒温箱中避光温育 30min。

3. 12,000 x g 离心 10min。

4. 加入适量标记缓冲液至上述超滤管中，并轻轻吹打混匀，12,000g 离心 10min， 重复此步骤多次。

5. 收集超滤管中的溶液（即生物素标记的抗体），加入等体积保存液，-20℃保存。

注意事项：

1.本试剂盒适用于所有含有伯氨基（NH2-）的大分子物质的标记，（蛋白，抗体，以及其他含有伯氨基（NH2-）的化合物分子），具体标记比例根据待标记物中氨基的数量确定；

2.本试剂盒中的生物素助溶剂为DMSO ，使用完毕后要密封干燥保存；

3.本试剂盒配备了标记物保存液，实验人员也可以根据被标记物的特点不同，选择更适合的保存液。

4.本试剂盒未开封前的有效期为18个月，请在有效期内使用。

5.本系列试剂盒提供的为超滤管分为不同的截留分子量和不同的最大容积，客户需要根据自己要标记的物质的分子量大小和标记量选择适合的型号。

*本试剂仅供实验室研究使用

生物素快速标记试剂盒常见问题和解答：

1.生物素与抗体的比例怎么计算？比如说标记1mL的2mg/mL的抗体（100kDa），大概添加比例是多少？

 答：一般抗体：生物素=1：20    摩尔比，抗体浓度高比例可以做到1：15，如果浓度低，建议1：20以上，最高可以做到1：50，前提是你必须做到定量是准确的。

2. 在标记过程中离心转速12000g不会对超滤管有影响吗？且超滤转速高时间长抗体会不会流失掉呢？标记的第1和4步说要反复离心的意思可以理解为置换缓冲液，相当于透析吗？

 答：标记的过程中超滤管的离心转速是12000rpm,不是12000g，当然每个离心机换算会有不同，不会对超滤管有影响，抗体的分子不会穿过超滤管的滤膜流失掉的。多次离心的目的就是要把原来溶液中的缓冲液置换成目的缓冲液，或者是通过反复超滤稀释，去除掉游离的小分子，和透析的作用是一样的。对于超滤的效果，主要看每次超滤前体积和超滤后剩余体积，以及超滤次数。

案例文献：

Screening of the candidate inhibitory peptides of subtilisin by in vitro RNA display technique

H Wang, P Song, X Li, Y Wang, S Gui, Y Liu… - International Journal of …, 2020 - Elsevier

…

Biotin modification of the purified subtilisin Savinase (Activity: 4.4 × 105 U/mL, from Tianjin Nuoao Technology Co., Ltd., China), was performed by using the biotin labeling kit (Friendbio Science & Technology Co., Ltd., China). A 10 kDa ultrafiltration tube (Millipore, USA) containing 500 μL of subtilisin solution was centrifuged and concentrated. Consequently, 200 μL of labeling buffer and 13.3 μL of super biotin solution were added and mixed, followed by an incubation of the mixture at 37 °C in the dark for 30 min. The mixture was centrifuged and concentrated at 12000 r/min for 10 min. The filtrate was discarded, and 300 μL of labeling buffer was added to the retention solution. The mixture was vortexed, followed by centrifugation and concentration. The retention solution was collected for the magnetic bead fixation after repeating the procedure twice. 100 μL of streptavidin (1 mg) magnetic beads (Wuxi BioMeg Biotechnology Co., Ltd., China) were taken in a magnetic bead tube and washed with PBS pH 7.4 thrice [41,42]. Subsequently, 100 μL PBS and 100 μL of biotin-modified subtilisin solution were added, and the mixture was shaken at room temperature for 30 min to keep the magnetic beads in suspension for immobilization. The subtilisin-immobilized magnetic beads were washed with PBS thrice and resuspended in 80 μL PBS.