重组蛋白纯化——离子交换柱纯化包涵体

1. 包涵体蛋白的获取

1.1 从半固体培养基平板上挑取一个表达菌单集落，加入2ml含有相应抗生素的LB培养基37℃培养活化过夜。

次日，2L培养瓶加入1L含相应抗生素LB培养基，接种1ml活化好的表达菌， 37℃振摇条件下培养至A600nm=0.6。

1.2 加入异丙基β-D-硫化半乳糖苷( IPTG)至0.5～1 mM，诱导目的蛋白表达；

1.3 诱导3～4h后，15 000 r/min离心15 min收获细胞，用小体积的培养上清液重悬细胞，然后将其转移至预先称重的50 ml离心管中，离心沉淀细胞。记录细胞沉淀的湿重，并冻存于-80℃备用。

（用此方法一般每升可得到1.5～2.0g湿重的大肠杆菌细胞。）

1.4 裂解细胞，用30 ml裂解缓冲液[50 mM Tris-HCl ( pH7.9 ), 0.1 mM EDTA,5%甘油，0.1mM DTT,0.1M NaCl]悬浮细胞，超声波破碎细胞至清亮（冰上操作， 60%功率4次，每次20秒，间隔1min）。

1.5 加入纯Triton X-100至终浓度为1%，吹打或者轻度超声以溶解和洗涤细胞膜蛋白；裂解物于冰上静置10min，然后15000r/min 离心15min沉淀包涵体，弃上清。

1.6 加入30ml含1% Triton X-100的裂解缓冲液洗涤包涵体，吹打或者轻度超声，冰上静置10min，然后15000r/min 离心15min沉淀包涵体，弃上清。

1.7 加入30ml裂解缓冲液洗涤包涵体，吹打或者轻度超声，冰上静置10min，然后15000r/min 离心15min沉淀包涵体，弃上清。此时,包涵体纯度达到90%左右。

2. 包涵体蛋白的溶解

将洗涤后的包涵体重悬于合适的变性缓冲液,使其变性和溶解;变性之后15000r/min离心15min去除残余不溶物。

（通常使用的变性缓冲液以裂解缓冲液为基础溶液，加入6M盐酸胍，8M尿素或者0.3%十二烷基肌氨酸钠等，变性和溶解的时间根据包涵体的性质确定，上文已经提及。）

3. 包涵体蛋白的复性

3.1 将变性的包涵体蛋白浓度调整到1mg/ml。

3.2 将包涵体蛋白滴加到快速搅拌的重折叠缓冲液中使其复性，滴加的第（9）步骤包涵体溶液的体积不超过溶液总体积的1/15。滴加完之后，静置2h以上。

4. 包涵体的纯化

4.1 步骤(10)的包涵体溶液15000r/min 离心15min弃除不溶物，或者低吸附0.22um过滤器过滤。包涵体的纯化可以选用合适的离子交换柱进行，上柱子尽可能快速，如果选用15ml柱子，复性蛋白上柱速度至少在10ml/min,必要时使用蠕动泵。

4.2 用5～10倍体积的洗涤缓冲液[0.1M NaCl,50mM Tris-HCl(pH7.9),5%甘油，0.1mM EDTA,0.1mM DTT]冲洗柱子,之后用10个体积的洗脱缓冲液【整个过程中，匀速将上述洗涤缓冲液中NaCl浓度从0.1M逐渐升到1M】,梯度洗脱流速为5ml/min,每3ml左右收集一管。整个过程中检测280nm吸光值，如果有条件同时检测320nm吸光值【320nm吸光值可能为多聚体】。

5. 包涵体蛋白的鉴定与保存

5.1 SDS-PAGE分析各个收集管的蛋白纯度。

（如果能够做酶活性分析的，对收集的各个组分做酶活性分析，如果有该蛋白标准品，可以通过标准酶活作酶活定量分析。）

5.2 蛋白样品保存：包涵体蛋白用含50%甘油的裂解缓冲液，-20℃或-80℃分装成小管保存。