重组蛋白纯化——包涵体的复性(蛋白重折叠)

1. 包涵体蛋白洗涤

包涵体的洗涤主要是洗掉尽可能多的细菌蛋白组分、DNA及细胞膜成分。常用2%脱氧胆酸钠（Sodium Deoxycholate）或1% Triton X-100洗涤，后者比前者更好，但是要选用高纯度的产品，不纯的产品含有大量的氧化剂影响，也可以选择低浓度的变性剂，如1～2M的尿素进行尝试，究竟哪种盐或者变性剂效果更好，需要实验者去做比较尝试。

2. 包涵体的溶解

对于接近天然状态的包涵体蛋白，用非离子去污剂或盐溶液（如0.5M/L  NaCl）就可以将其溶解,但是，大部分的包涵体需要通过促溶变性剂才可以溶解，促溶变性剂需要溶解在裂解缓冲液里面，以维持稳定的溶液环境，溶解温度一般在室温进行即可，溶解时间为60min左右，必要时可以适当加温或者通过超声波助溶。

3.常用的促溶变性剂

3.1 盐酸胍 比较强的变性剂，通常的使用浓度为6M,一旦蛋白质完全溶解，将其浓度降低到3M时也不会轻易发生沉淀，在浓度为1～2M时，部分蛋白质开始复性，如果复性后的蛋白想要通过离子交换进行纯化，其盐酸胍浓度必须降低到0.1M以下。

3.2 尿素 尿素的通常使用浓度为8M，尿素的促溶和变性效果不如盐酸胍，并且尿素中含有氰酸盐，会造成蛋白的氨甲基化，氨甲基化导致蛋白功能、理化性质发生变化。因为氰酸盐在尿素中的产生是一个动态的平衡，无法根除，所以为了避免氰酸盐对蛋白质的影响，可以使用适当的清除剂将其浓度适当降低来减少其对蛋白纯化的影响，福因德生物可以提供尿素氰酸盐去除试剂。

3.3 十二烷基肌氨酸钠（SKL)或十二烷基磺酸钠（SDS），十二烷基肌氨酸钠是一种强阴离子变性剂，可以帮助包涵体蛋白在高浓度下重新折叠，通常使用浓度为0.3%，其溶解包涵体蛋白的总质量不超过自身质量。SDS与SKL相比，其结合力更强，不容易解离，实验者更愿意使用后者。

4. 包涵体复性的条件筛选

• PH值：5～9(pH8～8.5效率最佳)。

• 温度：一般在室温情况下进行就可以，温度太高容易造成蛋白的热损伤。

• 盐浓度：一般适用50～100mM的盐浓度来增加蛋白质的溶解度。

• 氧化还原剂: 氧化还原剂一般是辅助二硫键的形成,常用的氧化还原组合有还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽,二硫苏糖醇和氧化型谷胱甘肽。

• 二价阳离子: 许多蛋白都含有二价阳离子作为其结构的一部分,比如Mg2+,Zn2+。

• 精氨酸和其他辅助氨基酸: 精氨酸可以减弱蛋白之间的聚集作用，给予蛋白充分的时间正确折叠。

• 甘油和糖类: 甘油是很好的蛋白质折叠添加剂，通常使用浓度为5%-30%，很多的糖类（如蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇和海藻糖）等也可以促进蛋白质的折叠，最佳使用浓度为0.5～1.5M。

• 其他的化学添加剂: 聚乙二醇、环糊精、甜菜碱等。

• 去污剂: 十二烷基肌氨酸钠，在高浓度下促使蛋白变性，低浓度下作为分子伴侣阻止重新聚集，促进折叠。

• 变性剂: 低浓度的变性剂（如1M尿素和0.5M盐酸胍）对解离聚集体稳定天然结构是有帮助的。

如此繁多的影响因素，实在不知道如何下手，福因德生物经过潜心研究，开发出包涵体蛋白重折叠试剂盒，可以通过微孔板快速微量实验快速找到您的包涵体最佳复性折叠条件，省去您大量摸索的过程。

5．蛋白质复性（重折叠）常用方法

最为常用的就是稀释法和透析法，稀释法又包括反向稀释、瞬时稀释和滴注稀释，透析法置换缓冲液比较缓慢，不论使用何种方法，最终都要尽可能控制蛋白质浓度，避免聚集。

5.1  柱上折叠：不论是离子交换柱还是分子筛色谱柱，因变性蛋白吸附在离子交换树脂表面或分布在分子筛色谱柱的孔道内，所以不会聚集，在变性剂浓度逐渐降低的情况下发生重折叠。

5.2  使用分子伴侣或者酶催化剂：常用的酶有脯氨酸异构酶和二硫键异构酶，催化二硫键的有DsbA和DsbB,促进折叠的有分子伴侣有GroEL/GroES。

5.3 碱性pH条件溶解和重折叠：有研究表明，包涵体中的部分蛋白是正确折叠的，在碱性条件下可以很好的溶解于低浓度变性剂，其中有很大一部分有蛋白活性。

6. 复性蛋白（重折叠）的纯化

一般采用高分辨率的离子交换柱进行纯化，纯化的过程中可以浓缩蛋白，去除变性剂、杂质、可溶性非正确折叠和可溶性蛋白质多聚体，如果想要去除内毒素，可在洗脱前用异丙醇清洗柱子。

7. 复性蛋白的鉴定

复性蛋白的鉴定需要清楚天然状态下该蛋白的活性，可行性的实验方法可以定量分析；如果想要确定活性蛋白的纯度还必须有完整活性的标准品用于比较。