重组蛋白纯化——可溶性蛋白纯化（GST）

来源：Frdbio丨发布时间： 2019-07-16 17:30:04丨 15193人浏览

谷胱甘肽亲和柱纯化带谷胱甘肽还原酶（GST)标签的融合蛋白

1.样品制备

与“SOP Ni-NTA层析柱亲和纯化6His标签融合蛋白”中样品制备方法相同，裂解缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，0.5% NP-40，0.5% Triton X-100，0.5mM DTT ，1mM PMSF，1mM NaF ，protease inhibitors cocktail，pH7.5) 。

（PMSF，DTT，protease inhibitors cocktail在破菌前加入。）

2.样品纯化

Glutathione Beads亲和树脂灌装层析柱或直接使用Glutathione Beads预装柱，层析柱下端接核酸蛋白检测仪。

2.1 平衡层析柱至工作温度，纯化过程可在室温或4℃进行。

2.2 将层析柱固定在支架上，让其流尽树脂保护液，快流干的时候用至少5倍体积的平衡/洗涤缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl，pH8.0)冲洗柱子。

2.3 制备的蛋白样品与平衡/洗涤缓冲液 1:1混合，加到平衡好的Glutathione Beads中（保证目的蛋白与Glutathione Beads充分接触，提高目的蛋白的回收率），收集流穿液。

2.4 用10～15倍柱床体积的平衡/洗涤缓冲液清洗柱床，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗涤液。

2.5 使用5～10倍柱床体积的洗脱缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl， 10mM还原型谷胱甘肽，pH8.0），收集洗脱液，即目的蛋白组分。还原型Glutathione易氧化，也容易影响pH,需现用现配,同时注意调pH 8.0。

3.SDS-PAGE检测分析纯化过程各组分

纯化过程中得到的样品（包括上样前样品液、流穿液、洗杂液和顺次收集的洗脱蛋白）以及原始样品使用SDS-PAGE检测分析纯化效果。

4.填料再生与保存

依次使用3倍柱床体积的平衡/洗涤缓冲液和5倍柱床体积的ddH2O平衡柱床，最后再用5倍柱床体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4℃保存。

5. 填料清洗

GST标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，这时需要对树脂进行清洗。

5.1 去除一些沉淀或变性物质

用2倍柱床体积的6M盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5倍柱床体积的PBS（pH 7.4）清洗。

5.2 去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质

用3～4倍柱床体积的70%乙醇或2倍柱床体积的1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱床体积的PBS， pH 7.4清洗。

6. 问题及解决方案

问题	原因分析	推荐解决方案
柱子反压过高	填料被堵塞	按照“5.填料清洗”部分进行树脂清洗。
	填料被堵塞	裂解缓冲液中含有微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜 (0.22或0.45 μm) 过滤，或者离心去除。
	样品太粘稠	样品中含有高浓度的核酸，加长破碎时间直至粘度降低，或者添加DNase I （终浓度5 μg/ml），Mg2+（终浓度为1 mM），冰上孵育10～15min。
	缓冲液太粘稠	有机溶剂或者蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。
洗脱组分中没有目的蛋白	GST标签蛋白变性了	使用温和的裂解条件，进行多种条件摸索。
	过度的裂解使目的蛋白变性	使用温和的裂解条件，进行多种条件摸索。
	目的蛋白聚集产生了沉淀	在细胞裂解前溶液中加入DTT，终浓度为1～20 mM。
	细菌裂解不充分，蛋白没有释放出来	优化裂解条件。
	表达蛋白包涵体过多	优化诱导表达条件使其尽可能在上清表达。
	融合蛋白改变了GST的构象，影响了目的蛋白的结合力	如果空载体中GST有很高的亲和力，有可能改变融合蛋白的构象从而降低了GST标签蛋白的亲和力。裂解液中加5mM DTT可以改善结合效果。
	融合蛋白改变了GST的构象，影响了目的蛋白的结合力	降低结合温度至4℃，充分地清洗。
	柱子平衡时间太短，目的蛋白不是在pH6.5～pH8范围内结合的	用 pH 6.5～pH 8.0的Buffer进行充分的平衡 (PBS) 。
目的蛋白没有完全洗脱下来	洗脱体积太少	增加洗脱液体积，减小洗脱流速。
	洗脱液中谷胱甘肽浓度太低	增加洗脱液中谷胱甘肽浓度，可尝试用50 mM Tris-HCl, 20～40 mM还原型谷胱甘肽, pH 8.0洗脱。
	低pH影响洗脱	在不增加洗脱液中的谷胱甘肽量时，提高洗脱液中pH至pH 8～9 会有改善。
	低pH影响洗脱	增加洗脱液中离子强度，如0.1～0.2 M NaCl。
	洗脱液中的谷胱甘肽被氧化	使用新鲜配制的洗脱液
	洗脱液中的谷胱甘肽被氧化	加入 DTT。
	非特异性疏水作用影响目的蛋白的溶解与洗脱	洗脱液中加入非离子型洗涤剂，如0.1%的Triton X-100 或者2%正辛基-β-D-吡喃葡糖苷Tween-20。
电泳或western blot检测中发现多条带	分子量70kD蛋白与目的蛋白一起被纯化出来	分子量70kD的蛋白有可能是大肠杆菌基因DnaK 的产物，可以通过在目的蛋白中加入（50 mM Tris-HCl, 2 mM ATP, 10 mM MgSO4, pH 7.4）在37℃加热10 min去除。
	分子量70kD蛋白与目的蛋白一起被纯化出来	可以通过ATP-琼脂糖胶或离子交换来去除目的蛋白溶液中的DnaK 蛋白。
	GST融合蛋白已经发生降解	在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，如加入1 mM PMSF。
	GST融合蛋白已经发生降解	有可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的，可以使用蛋白酶缺陷型宿主菌(如 lon-或ompT)。
	细胞破碎过度	减少细胞破碎时间，超声前加入溶菌酶(菌液体积的0.1 倍的 10 mg/ml溶菌酶，25 mM Tris-HCl, pH 8.0)，避免发泡导致蛋白变性，过度超声破碎增加宿主内源蛋白与GST融合目的蛋白的共纯化。
	上柱后洗涤不充分	增加样品纯化环节第3）步平衡/洗涤缓冲液清洗柱床时间。
	共价共纯化	包括促进蛋白正确折叠的分子伴侣的共纯化，如：DnaK (Mr ～70 kD)， DnaJ (Mr ～37kD)， GrpE (Mr～ 40 kD)，GroEL (Mr～ 57kD) 和 GroES (Mr～10kD)。可尝试再次纯化改善。
	目的蛋白与其他蛋白非特异性结合	在裂解液加入5mM DTT降低非特异性结合。

标签纯化类型	产品名称	产品特点
6His标签蛋白纯化	Frdbio Ni IDA Beads	具有蛋白载量高，性价比高等优点。
	Frdbio Ni NTA Beads	稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。
	Frdbio Ni NTA kit	Ni NTA预装柱，使用更方便。
	Frdbio Ni Super beads	新型的金属离子螯合填料, 可以耐受非常苛刻的实验条件, 镍离子脱落量低, 咪唑使用浓度低,选择特异性高。
GST标签蛋白纯化	Frdbio Glutathione Beads	树脂载量大于20mg GST融合蛋白。Glutathione Beads具有载量高、特异性好、性价比高的特点。
GST标签蛋白纯化	Frdbio Glutathione Kit	Glutathione Beads预装柱，使用更方便。
MBP标签蛋白纯化	Frdbio Dextrin Beads	带有麦芽糖结合蛋白（MBP）标签蛋白的亲和层析介质, 可以用10mM麦芽糖进行温和洗脱。
MBP标签蛋白纯化	Frdbio Dextrin Beads kit	Dextrin Beads预装柱，使用方便。
Strep II标签蛋白	Frdbio Strep-Tactin Beads	Strep II标签为8个氨基酸的小标签（WSHPQFEK）。
Strep II标签蛋白	Frdbio Strep-Tactin Beads kit	Strep-Tactin Beads预装柱，使用更方便。

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