基因的获取——mRNA的获取

原核表达必须要先获取基因，通常有以下几个途径：

A.从物种mRNA提取反转录到cDNA模板，通过引物特异性扩增获取。

B.直接从质粒或提取的基因组扩增获取。

C.基因合成：不易获取或者需要密码子优化的基因可以考虑基因合成。

D.mRNA的获取：动物组织及细胞mRNA的提取制备

1.1 准备工作

1.1.1新鲜标本/-80冻存样本/液氮储存的标本（保证样品mRNA不降解）。

1.1.2购买无RNA酶耗材/器材或器材（匀浆器，离心管及枪头）作RNA酶清除处理：

0.1%的DEPC水浸泡过夜后用蒸馏水清洗，126灭菌30min，或用蒸馏水浸泡清洗，灭菌三次。

1.2 动物组织mRNA提取

将组织样本转入匀浆器中，每100mg组织样本加入1ml Trizol提取液, 磨匀至无块状物【匀浆液】。

1.3 细胞RNA提取

1.3.1 提取单层贴壁生长细胞RNA：吸尽培养液后，每5～10×106个细胞加入1ml的Trizol，室温放置5～10 min，每隔2min晃动一次裂解细胞。

1.3.2 提取悬浮生长细胞的RNA：离心沉淀细胞，每5～10×106个细胞加1ml的Trizol，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞。

注意事项：

a.加入Trizol前应避免洗涤细胞而增加mRNA降解的可能性。

b.细胞充分裂解无团块。

1.4 将匀浆液转移至离心管中，室温放置5min。

1.5 按匀浆液/氯仿=5:1的体积比加入氯仿，剧烈震荡15s后室温放置5min。

1.6 12,000rpm，4离心15min，吸取水相上清至新离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，充分混匀后置-20 1～2h或室温0.5h。

1.7 12,000rpm，4离心10min弃上清，管底沉淀为RNA。

1.8 加入0.5～1ml 75%乙醇重悬洗涤RNA，12,000rpm离心5min。

1.9 小心吸净液体，加入50μl ddH2O，55 5～10min即可完全溶解。

1.10 RNA保存于-80备用。

目前商品化的mRNA提取试剂/试剂盒已经非常成熟，针对不同类型的样品应该使用不同类型的提取试剂。商品化试剂盒更能保证实验结果的稳定，特别是适合于珍贵样品。福因德生物推出系列RNA提取纯化试剂盒可供选择。

重组蛋白基因的获取

2. 植物组织/细胞RNA提取

植物组织富含的酚类化合物、多糖及高活性RNase会与RNA 相互作用：酚类化合物被氧化后与RNA 不可逆地结合，导致RNA 活性丧失及在后续抽提时RNA 的丢失，或形成不溶性复合物；而多糖会形成难溶的胶状物,与RNA 共沉淀；萜类化合物和RNase 会造成RNA 的化学降解和酶解。因此常规的RNA提取方法(如胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等) 难以对所有的RNA提取都能奏效，常导致以下三种情况:提出的RNA 已被降解；RNA 的得率很低;得到的RNA 不能进行体外反转。

针对以上问题，福因德生物通过优化配方和实验流程，推出了适合于不同需求的植物RNA提取试剂：FrdbioR ZOL 植物总 RNA 提取试剂主要针对常规植物的RNA提取；FrdbioR 多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒通过独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活RNA酶，助提剂快速结合多糖多酚物质并通过离心去除，RNA在高盐状态下吸附于离心柱内硅基质膜上，漂洗离心去除细胞代谢物、蛋白等杂质，低盐溶液从硅基质膜上将RNA洗脱；最后通过DNase I消化DNA得到无DNA残留的高质量RNA。

3.RNA的保存

mRNA非常容易降解，是该领域一个棘手问题也是个难题。针对这个问题福因德生物开发出专用的RNA保存试剂。

4.RNA质量检测：主要包括纯度检测和完整性检测：

4.1纯度检测：R=OD260/OD280=1.8～2.1(质控点：R< 1.8蛋白污染, R > 2.2，RNA降解，理想的R=2.0，含Tris溶液R偏高，但不超过2.2)。

4.2完整性检测：

检测方法琼脂糖凝胶电泳。质量较高的RNA，电泳显示有三条带，并且28s是18s的两倍，5s很弱。

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