蛋白表达

蛋白的重组表达是指将外源基因克隆在含有特定启动子的表达载体中，让其在大肠杆菌中在IPTG的诱导下过量表达。不同蛋白适合不同的表达体系，包括表达载体、宿主菌株、诱导条件。

表达载体的选择：

融合蛋白表达载体的选择受多因素限制，首先载体上要有合适的多克隆位点。其次需要根据后续的蛋白纯化条件选择合适的融合标签，常用的融合标签有His.Tag、GST.Tag、Nus.Tag和Trx.Tag。其中His标签比较小，对蛋白的结构性质没有明显的影响，亲和层析纯化后可以不作标签切除的处理；但是像GST这样稍大的标签在后续过程中需要用专一性酶切除。在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白，特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括载体，其中带有GST.Tag的载体可以增加融合蛋白的溶解性。

宿主菌株的选择：

相同的蛋白在不同的宿主中表达状态可能会有所不同，目前应用最广泛的是BL21系列宿主。而从BL21衍生而来的Rosetta宿主菌可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs。这样Rosetta菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。BL21(DE3)宿主有利于包涵体形成。

诱导条件：

诱导条件的改变同样影响蛋白的表达，一般实际应用中需要的大多是可溶性蛋白，这就需要摸索最适的诱导温度。大部分蛋白在低温（15～25℃）过夜诱导的条件下合成的可溶性蛋白的比例会比较大。此外诱导剂的浓度对蛋白的表达状态也是有影响的，低浓度诱导剂有利于可溶性蛋白的表达。较高的温度可能增加了蛋白质合成的速度、折叠中间体形成聚集体的速度以及疏水相互作用力，表达的蛋白质易于以包涵体的形式存在。而较高浓度的诱导剂（0.8～10mM IPTG）也能促进菌体中包涵体的形成。对于带普通T7启动子的pET重组子，终浓度为0.5mM的IPTG可以实现完全诱导，而带有T7lac启动子的载体则需要终浓度为0.8mM的IPTG才能完全诱导。

在一些DE3宿主菌中通过调节IPTG的浓度可以改变蛋白表达的水平，一般在进行蛋白的大量表达之前会进行小量的测试诱导，确定最佳IPTG浓度和最适的的诱导温度使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性。诱导的具体操作见下文。

实验前需要配置的试剂：

LB液体培养基（1L）：10g NaCl、5g Yeast extract、10g peptone

TAE Buffer：(50×,1L)：242g Tris、37.2g Na2EDTA·2H2O、57.1ml醋酸，调pH 8.5

Lysis Buffer：50mM Tris、250 mM NaCl、0.34g咪唑，调pH 8.0

SDS-PAGE Buffer(5×,1L)：15.1g Tris、94g Glycine、5g SDS

Loading Buffer(5×,5ml) ：250mM Tris-HCl（pH6.8）、10％（W/V）SDS、50％（V/V）甘油、5％（W/V）DTT

Wash Buffer(His标签用,1L)：8g NaCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4、0.2g KCl、3.4g咪唑，调pH8.0

Elution Buffer(His标签用,1L)：8g NaCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4、0.2g KCl、17g咪唑，调pH8.0

Wash Buffer(GST标签用,1L)：50ml 1.0MTris-HCl、5.84g NaCl、0.771gDTT、0.116g EDTA，调pH8.0

Elution Buffer(GST标签用)：50mM Tris-HCl、20 mM GSH，调pH8.0

透析液（PBS,1L）：8g NaCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4、0.2g KCl，调pH7.3

缓冲液A：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、 100mM NaCl、1%Triton X-100

缓冲液B：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton X-100、 2M脲素

缓冲液C：50mM Tris-HCl (pH8.5)、 1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton X-100、 2M盐酸胍

溶解缓冲液D：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、10mM DTT、2mM脱氧胆酸钠、8M脲素

小量诱导表达

一般在进行大量的蛋白诱导表达之前会先进行预实验，预实验主要是以实验室最基本的诱导条件为基础进行小量诱导，以初步检测目标蛋白是否能够表达。以下是蛋白小量诱导表达的详细操作步骤：

⑴ 重组质粒的转化

质粒转化步骤同连接产物的转化。若由于密码子优化需要的费用较高，在构建载体时没有进行优化，则可以选择本公司的不同宿主进行诱导，以达到最优效果。

 ⑵ 挑取含重组质粒的单个表达单菌落至2ml LB（含对应的抗生素）中37℃过夜培养。

⑶ 按1∶50比例接种扩大培养，37℃震荡培养至OD600至0.4-1.0（最好0.6，大约需3h）。

⑷ 在OD600达到0.4～0.8后加入IPTG诱导剂进行诱导，并且对IPTG的浓度，诱导温度设置交叉实验，以获得最优诱导条件，同时设置一组不加诱导剂的作为对照，37℃震荡培养3h。

⑸ 分别取菌体1ml，12,000g离心30s收获沉淀，用100μl PBS重悬，混匀，100℃ 10min。

⑹ 12,000g离心1min，取上清作为样品，用作SDS-PAGE等分析。

根据预测的蛋白的大小制备相应的分离胶，小样检测目表蛋白是否表达。

对于蛋白质检测这一部分，目前已经有许多商品化的试剂出售，例如电泳过程中的SDS-PAGE电泳缓冲液（Frdbio,Cat NO.WBR0301）福因德科技（Frdbio）有现成的配好的试剂购买，无需自己花时间配制，此外，由于用于制PAGE胶的丙烯酰胺有神经毒性，福因德科技（Frdbio）也有制胶试剂盒（Frdbio,Cat NO.WBR0401）供大家选择。

注：福因德科技（Frdbio）生产的自动诱导培养基－IntelligentT7表达培养基（Frdbio,Cat NO.PRE0012）可使用方便，中途无需人为加入诱导剂，菌液摇到饱和时自动开启目标蛋白表达模式，且可使蛋白表达量提高几倍甚至十倍。另外，毒性蛋白表达的难题也可以用此自诱导培养基解决。

对于目标蛋白没有成功表达的主要从以下几个方面去思考：

⑴ 载体构建是否出现问题，比如由于人为的原因导致的读码框错误。

⑵ 蛋白诱导表达的条件是否合适，更换诱导的条件，比如诱导温度、IPTG浓度等。

⑶ 是否需要更换载体，有的蛋白表达不出来但是在更换表达载体后又能够正常表达了。

⑷ 目的基因本身是否含有许多稀有密码子，尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。

⑸ 菌体内的质粒是否丢失，当选用带氨苄青霉素抗性的载体时，有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。

⑹ 表达重组的蛋白是否为毒性蛋白，对宿主细胞有毒性，致使菌体裂解。对于这种情况可通过更换宿主细胞来解决，比如Rosetta(DE3)（Frdbio,Cat NO. MCC0050）。

⑺ 是否需要更换宿主，不同的宿主菌其基因型是不一样的。有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。因此，当目的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌