Anti-DYKDDDDK Magarose Beads

1.产品介绍

Flag标签是一个由八个亲水 氨基酸组成的多肽片段，定位在融合蛋白表面，因此更易与对应抗体结合以及被肠激酶分解。Magarose Beads系列产品具有超顺磁性、快速磁响应性、丰富羟基官能团和相对集中的粒径等特点，是医学与分子生物学研究中重要的载体工具。Anti-DYKDDDDK Magarose Beads是以抗Flag (DYKDDDDK) 抗体为亲和配体，可-步纯化原核、酵母或哺乳动物细胞表达的flag标签融合蛋白。

表1. Anti-DYKDDDDK Magarose Beads产品性能

2.试剂准备

2.1样品准备

上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值,可以用平衡液对样品或细胞培养液稀释,或者用平衡液透析。

样品在.上样前建议离心或用0.22 μm或0.45 um滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2.2缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22 μm或0.45 um滤膜过滤。

平衡/洗杂液: 50 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH7.4

洗脱液: 0.1 M Glycine-HCl, pH3.0

竞争性洗脱液: 50 mM Tris, 0.15 M NaCl, 100-500 ug flag多肽/ml, pH7.4

中和液: 1 M Tris-HCI, pH8.0

3.样品纯化

根据两种应用来介绍产品的使用方法:蛋白纯化流程和IP流程。

3.1磁珠预处理

将Anti-DYKDDDDK Magarose Beads颠倒数次,保证磁珠完全混匀，取计算量(根据样品体积和所含样品含量计算)的磁珠悬浮液,转移至离心管中,放置在磁分离器上,静置大约1 min,待溶液变澄清后，用移液器吸弃清液。将离心管磁分离器上取下来,加入与悬浮液等体积的平衡液，使用枪头反复吹打5次,将离心管置于磁分离器上,大约1 min,待溶液变澄清后，用移液器吸弃清液，重复洗涤2次。

3.2 Flag标签蛋白纯化

1)磁珠结合目的蛋白:在步骤3.1预处理的磁珠管中加入样品溶液，漩涡振荡均匀,在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管,促使样品和磁珠充分接触并吸附,混合30 min以上(具体时间根据结合效果调整)，置于磁分离器上,大约1 min,待溶液变澄清后,吸取并保留上清液，作为流穿样品，用于后续检测。

2)磁珠洗杂:向离心管中加入5倍磁珠体积的洗杂液，振荡悬浮，置于磁分离器上,大约1 min,待溶液变澄清后，吸弃上清液。该操作重复两次以上。

3)洗脱目的蛋白:

A酸性洗脱:

在上述离心管中加入3 5倍磁珠体积的酸性洗脱液(0.1 M Glycine-HCl, pH3.0), 用移液器吹打5次，然后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，5-10 min后,置于磁分离器上，大约1 min,待溶液变澄清后，吸取并保留上清液，为洗脱组份，即为目标蛋白。该操作建议重复两次。向洗脱组分中加入洗脱体积十分之一的中和液,调节pH值至7.0-8.0。

注:酸性洗脱后磁珠要立即用平衡液平衡, Anti-DYKDDDDK Magarose Beads在洗脱液中不要放置超过20 min。

B竞争性洗脱:

使用3-5倍磁珠体积的竞争性洗脱液(lag 多肽含量100 μg/ml)洗脱，2-8C孵育30 min,将离心管置于磁分离器上大约1 min,待溶液变澄清后，小心取出上清，不要吸到填料,为洗脱组份。洗脱样品放置4C,长时间放置20C保存。

C:变性洗脱:

此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。SDS PAGE Loading Buffer中含有β巯基乙醇或DTT,可以使填料上抗体配体重链和轻链断开(大小分别为50和25 kDa)。另外所含有的SDS可以使Anti-DYKDDDDK抗体变性，洗脱后的Anti-DYKDDDDK Magarose Beads没办法重复使用。每管中加入磁珠体积等量的2XSDS-PAGE Loading Buffer, 95C加热10 min。将离心管置于磁分离器上，大约1 min,待溶液变澄清后，吸取上清SDS-PAGE电泳检测，也可以离心后取上清用于电泳检测。

注: Anti-DYKDDDDK Magarose Beads再生效果受限，请谨慎使用。

3.3 IP/Co-IP操作流程

1)磁珠结合靶蛋白:将含有Flag 标签的靶蛋白样品加入到步骤3.1处理好的磁珠中，颠倒混匀。将离心管置于混合仪上,室温孵育30 min以上(具体时间根据结合效果调整)。

2)磁珠洗杂:将离心管置于磁分离器，大约1 min,待溶液变澄清后，用移液器移出上清液，保留，以备取样检测。向离心管中加入5倍悬浮液体积的洗杂液，使用枪头反复吹打5-10次，将离心管置于磁分离器上,大约1 min,待溶液变澄清后，用移液器吸弃上清液。重复上述步骤2次。即得到靶蛋白~磁珠复合物。如果进行的是IP实验，则跳过3、4两步,直接进行第5步。

3)目标蛋白与靶蛋白-磁珠复合物的结合:将含有目标蛋白样品加入到处理好的靶蛋白-磁珠复合物中,颠倒混匀。将离心管置于混合仪上,室温孵育30 min以上(具体时间根据结合效果调整)。

4)磁珠洗杂:将离心管置于磁分离器，大约1 min,待溶液变澄清后，用移液器移出上清液，保留，以备取样检测。向离心管中加入5倍悬浮液体积的洗杂液，使用枪头反复吹打5-10次，将离心管置于磁分离器上,大约1 min,待溶液变澄清后，用移液器吸弃上清液。重复上述步骤2次。目标蛋白通过与靶蛋白的结合,从混合体系中被捕获。

5)洗脱目的蛋白:

A酸性洗脱:

在上述离心管中加入3-5倍磁珠体积的酸性洗脱液(0.1 M glycine HCI, pH3.0), 用移液器吹打5次，然后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，5-10 min后，置于磁分离器上，大约1 min,待溶液变澄清后,吸取并保留上清液，为洗脱组分，即为目标抗体。该操作建议重复两次。向洗脱组分中加入洗脱体积十分之一的中和液，调节pH值至7.0-8.0。

注:酸性洗脱后磁珠要立即用平衡液平衡，Anti-DYKDDDDK Magarose Beads在洗脱液中不要放置超过20 min。

B竞争性洗脱:

使用3-5倍磁珠体积的竞争性洗脱液(f1ag 多肽含量100 ug/ml)洗脱，2-8℃孵育30 min,将离心管置于磁分离器上大约1 min,待溶液变澄清后，小心取出上清，不要吸到填料,为洗脱组份。洗脱样品放置4C,长时间放置20℃保存。

C变性洗脱:

此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。SDS-PAGE Loading Buffer中含有β巯基乙醇或DTT,可以使填料上抗体配体重链和轻链断开(大小分贝为50和25 kDa)。另外所含有的SDS可以使Anti-DYKDDDDK抗体变性，洗脱后的Anti-DYKDDDDK Magarose Beads没办法重复使用。每管中加入磁珠体积等量的2XSDS-PAGE Loading Buffer, 95C加热10 min。将离心管置于磁分离器上，大约1 min,待溶液变澄清后,吸取上清SDS-PAGE电泳检测，也可以离心后取上清用于电泳检测。

4.试剂兼容性

表2.Anti-DYKDDDDK mgarose Beads 试剂兼容性

5.问题及解决方案

*本试剂仅供实验室研究使用