一. 产品介绍

Protein A Agorase Beads 是用于分离和纯化单克隆抗体的亲和层析介质，具体性能见表1。Protein A 是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc 片段结合哺乳动物IgG。Protein A Agorase Beads 的配体蛋白Protein A 是在天然蛋白A 的基础上进行生物工程突变得到的一种耐碱蛋白A(Alkaline tolerate，故缩写为At)。

该产品以0.1M NaOH 进行200 次在位清洗，介质载量几乎不变，以0.5M NaOH 进行100 次在位清洗，载量仍可达到最初载量的80%，更加方便客户尤其是工业客户的清洗操作。该产品采用较稳定的定向偶联，脱落量低（小于10ng/mg IgG,见图1）。

Protein A Agorase Beads 是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，可以在相对较高的流速下进行单克隆抗体和多克隆抗体的纯化，其耐压性能见图2，因此Protein A Agorase Beads 适用于工业化抗体的大规模生产。

表1. Protein A Agorase Beads 产品性能

                图1. CIP 清洗后Protein At 脱落量

    图2.介质的压力/流速曲线（层析柱BPG300,柱高20cm）

二. 纯化流程

1. Buffer 的准备

所用水和Buffer 在使用之前建议用0.22μm 或0.45μm 滤膜过滤。

结合缓冲液/洗涤缓冲液：0.15 M 氯化钠、20 mM 磷酸氢二钠，pH7.0

洗脱液：0.1 M 甘氨酸，pH 3.0

中和液：1 M Tris-HCl 缓冲液，pH 8.5 。

2.样品准备

上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH 值，可以用结合/洗涤缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗涤缓冲液透析。样品在上样前建议离心或用0.22μm 或0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

3. Protein A Agorase Beads 装填

Protein A Agorase Beads 被广泛应用于工业纯化，因此，涉及到各种中压色谱层析柱的填装，下面介绍使用Protein A Agorase Beads 填装层析柱的方法。

层析柱的装填（使用储液器装填）

1). 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm 的去离子水。

2). 将树脂悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。

3). 如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。

4). 打开层析柱底部出口，开起泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，这样也可以得到一个很好的装填效果。（注意：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%）当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3 倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。

5). 关闭泵，关闭层析柱出口。

6). 如果使用储液器，去除储液器，将分配器至于层析柱中。

7). 将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。

8). 将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。

4.样品纯化

1). 将Protein A Agorase Beads 装入合适的层析柱，层析用5 倍柱体积的结合Buffer 进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。

2). 将样品加到平衡好的Protein A Agorase Beads 中（保证目的蛋白与Protein A Beads4FF 充分接触，提高目的蛋白的回收率），收集流出液。

3). 用10-15 倍柱体积的洗杂Buffer 进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4). 使用5-10 倍柱体积的洗脱Buffer，收集洗脱液，即目的蛋白组分。

5). 依次使用3 倍柱体积的结合Buffer 和5 倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5 倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4 度保存，防止填料被细菌污染。

注：首次使用时，可先按照4 填料清洗中CIP 清洗一遍，避免脱落的配体残留。

5.SDS-PAGE 检测

将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE 检测纯化效果。

三. 残留配体去除

Protein A Agorase Beads 配体的脱落很低，小于10ng/mg 抗体。但是很多产品需要完全去除，可采用阳离子交换、阴离子交换或凝胶过滤等方法去除，具体参照阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和凝胶过滤树脂的使用。

四. 填料清洗

Protein A Agorase Beads 可以重复使用而无需再生，但随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，严重影响柱子的性能，这时需要对树脂进行清洗。

Protein A Agorase Beads 是一种耐碱亲和介质，可以耐受0.1M-0.5M NaOH 溶液的清洗，成本低，效果好，具体操作：

1.3 倍柱体积的结合液；

2.至少2 倍柱体的0.1–0.5 M NaOH，接触时间为15 minutes；

3.5 倍柱体积的结合液冲洗。

注：因0.1–0.5 M NaOH 粘度大易造成压力增加，可进行反向冲洗。

五. 问题及解决方案