Anti-DYKDDDDK Affinity Beads

1.产品介绍

Flag标签是一个由八个亲水 氨基酸组成的多肽片段，定位在融合蛋白表面，因此更易与抗体结合以及被肠激酶分解。Anti-DYKDDDDK Affinity Beads是以抗Flag(DYKDDDDK)抗体为亲和配体，-步纯化原核、酵母或哺乳动物细胞表达的Flag标签融合蛋白。Anti-DYKDDDDK Affinity Beads以4%琼脂糖凝胶为基质,杂蛋白非特异性结合少，可用于Flag标签融合蛋白的纯化和免疫沉淀(IP)。

表1. Anti-c-Myc Affinity Beads产品性能

2.试剂准备

2.1样品准备

上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用平衡液对样品或细胞培养液稀释,或者用平衡液透析。

样品在.上样前建议离心或用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2.2缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22 μm或0.45 um滤膜过滤。

平衡/洗杂液: 50 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH7.4

酸性洗脱液: 0.1 M glycine HCI, pH3.0

竞争性洗脱液: 50 mM Tris, 0.15 M NaCI, 100-500 μg flag多肽/ml, pH7.4

中和液: 1 M Tris-HCl, pH8.0

3.样品纯化

3.1柱层析

1)将Anti-DYKDDDDK Affinity Beads装入合适的层析柱，层析用5倍柱体积的平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下。

2)将样品加到平衡好的Anti-DYKDDDDK Affinity Beads中，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。

3)用10倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4)A酸性洗脱:使用5倍柱体积的酸性洗脱液洗脱，收集管中预先加好中和液，加入量15-25ul中和液/ml洗脱液，分管收集。注:酸性洗脱后填料要立即用平衡液平衡，Anti-DYKDDDDK Affinity Beads在洗脱液中不要超过20 min。

B竞争性洗脱:使用5倍柱体积的竞争性洗脱液洗脱。分管收集。

5)使用3倍柱体积的洗脱液再生，然后用平衡液平衡至中性。

6)然后保存在含0.02%叠氮化钠的PBS溶液中，2-8℃保存。

3.2静态吸附

1)填料准备:取适量的Anti-DYKDDDDK Affinity Beads加入层析柱中，流干保护液。加入5倍柱体积的平衡液清洗。

2)加入样品溶液，4℃或室温震荡孵育至少30 min(不能磁力搅拌),确保填料与样品溶液充分混合。

3)孵育完毕后，将填料混合液离心(5000xg 离心1 min)或过滤收集填料。

4)将填料装入层析柱中,用平衡液清洗直至紫外稳定。

5)用酸性洗脱液或竞争性洗脱液洗脱，参考3.1中4)。

6)填料再生和保存参考3.1中5)和6)。

3_3免疫沉淀操作流程

1)填料准备:取40 μl的Anti-DYKDDDDK Affinity Beads (柱体积20 u1)混合液加入到2 ml离心管中, 5000xg 离心1 min,吸弃上清。

2)填料加入0.5 ml平衡液，悬浮填料(使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,起到保护蛋白的作用), 5000xg离心1 min,吸弃上清。重复-次。

3)加入200-1000ul样品裂解液到处理好的填料中,混合均匀,在室温下置于翻转混合仪轻轻翻转离心管，促使样 品和填料充分接触并吸附，室温至少1h。5000xg 离心1 min,吸弃上清。

4)洗杂:加入0.5 ml的洗杂液，悬浮填料,轻轻混匀, 5000xg 离心1 min,吸弃上清。再重复三次。确保去除非特异性吸附。

5)样品洗脱:可根据后期检测的需要选择不同的洗脱方法。

A:酸性洗脱

加入100μl酸性洗脱液,悬浮填料。室温孵育5 min, 5000xg离心1 min。小心取出上清,不要吸到填料,用中和液中和。洗脱样品放置4℃,长时间放置20℃保存。

B:竞争性洗脱

加入100ul竞争性洗脱液洗脱。室温孵育30 min, 5000xg离心1 min。小心取出上清,不要吸到填料。洗脱样品放置4℃,长时间放置-20℃保存。

C:变性洗脱

实验室常规蛋白.上样缓冲液(Loading Buffer)中含有β巯基乙醇和DTT,可以使填料中抗体重链和轻链断开。含有SDS的样品缓冲液可以使Anti-DYKDDDDK抗体变性,洗脱后的Anti-DYKDDDDK Affinity Beads没办法重复使用。每管中加入20 ul 2x Loading Buffer, 95℃加热5min。5000xg 离心1 min,吸取上清SDS-PAGE电泳检测。

4.试剂兼容性

表2.Anti-DYKDDDDK Affinity Beads 试剂兼容性

4.问题及解决方案

*本试剂仅供实验室研究使用