一. 产品介绍

rProtein G Beads 4FF是用于分离和纯化lgG的亲和层析介质，具体性能见表1。ProteinG是一种分离自G Streptococci的细胞壁蛋白，它可通过其Fc 片段结合哺乳动物IgG。重组protein G含有高亲和结合位点，减少了非特异性吸附。Protein G 和Protein A 有不同的lgG结合特性，相比Protein A， Protein G对牛、羊、马等多克隆抗体有更强的结合力，它还可以结合不能与Protein A 很好结合的大鼠lgG、人lgG3和小鼠lgG1。rProtein G Beads 4FF是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，可以在相对较高的流速下进行单克隆抗体和多克隆抗体的纯化。

表1. rProtein G Beads 4FF产品性能

二. 纯化流程

1. Buffer 的准备

所用水和Buffer 在使用之前建议用0.22μm 或0.45μm 滤膜过滤。

结合缓冲液/洗涤缓冲液：0.15 M 氯化钠、20 mM 磷酸氢二钠，pH7.0

洗脱液：0.1 M 甘氨酸，pH 3.0

中和液：1 M Tris-HCl 缓冲液，pH 8.5 。

2. 样品准备

上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH 值，可以用结合/洗涤缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗涤缓冲液透析。样品在上样前建议离心或用0.22μm 或0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

3.rProtein G Beads 4FF装填

rProtein G Beads 4FF被广泛应用于工业纯化，因此，涉及到各种中压色谱层析柱的填装，下面介绍使用rProtein G Beads 4FF填装层析柱的方法。

层析柱的装填（使用储液器装填）

1)用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm的去离子水。

2)将树脂悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。

3)如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。

4)打开层析柱底部出口，开起泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，这样也可以得到一个很好的装填效果。（注意：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%）当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3 倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。

5)关闭泵，关闭层析柱出口。

6)如果使用储液器，去除储液器，将分配器至于层析柱中。

7)将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。

8)将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。

4.样品纯化

1) 将rProtein G Beads 4FF装入合适的层析柱，层析用5 倍柱体积的结合液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。

2) 将样品加到平衡好的rProtein G Beads 4FF中（保证目的蛋白与rProtein G Beads4FF充分接触，提高目的蛋白的回收率），收集流出液。

3) 用10-15倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4) 使用5-10倍柱体积的洗脱液，收集洗脱液，即目的蛋白组分。

5) 依次使用3 倍柱体积的结合液和5 倍柱体积的去离子水平衡填料，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4度保存，防止填料被细菌污染。

5.SDS-PAGE 检测

将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。

三. 填料清洗

rProtein G Beads 4FF可以重复使用而无需再生，但随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，严重影响柱子的性能，这时需要对树脂进行清洗。去除一些沉淀或变性物质用 2倍柱体积的6M盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5 倍柱体积的PBS, pH 7.4 清洗。去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质用 3-4倍柱体积的70%乙醇或2 倍柱体积的1% Triton™ X-100 清洗，然后然后立即用5倍柱体积的PBS, pH 7.4清洗。

去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质

用 3-4倍柱体积的70%乙醇或2 倍柱体积的1% Triton™ X-100 清洗，然后然后立即用5倍柱体积的PBS， pH 7.4清洗。

四. 问题及解决方案