产品介绍：

2-（4-羟基苯偶氮）苯甲酸(2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid ,英文缩写HABA)可以与亲和素特异性结合，其结合复合物为一种黄色或者橘黄色，在500nm有最大吸光值；但是其结合力远远低于生物素与亲和素的结合，当溶液中存在生物素的时候，生物素会强竞争让HABA解离下来,引起吸光值下降。基于此原理，可以根据500nm吸光值的变化计算出蛋白标记生物素的量（被标记蛋白与生物素的摩尔比）。

生物素标记摩尔比的计算是基于比尔-朗伯定律（Beer–Lambert law），又称比尔定律或比耳定律（Beer's law），是分光光度法的基本定律，即当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度（Absorbance，A）与吸光物质的浓度（Consenreation，C）及吸收层厚度（length，L）成正比, 用公式表示为：A = ε*C* L其中A为光度，ε为摩尔吸光系数,所以此处公式为A 500= ε500 C L（此处ε500=34,000M-1cm-1）

主要组分：         

储存条件：

该试剂盒在低温下运输，收到后请置于2-8℃保存，保存时间2年以上。

实验前准备：

HABA- Avidin混合液配制：5mg Avidin和300uL HABA加入到9.7ml PBS溶液中，（合格标准：1cm比色皿A500=0.9 ~ 1.3,）配置好的混合液可以在4℃保存，2周内可以正常使用，如果发现有沉淀或者絮状物，请过滤或者离心后使用。

实验操作可以选择分光光度法或微孔酶标板法：

分光光度法：

A． 取900uL HABA- Avidin混合液放入1cm光程比色杯，在500nm波长测量吸光值，记录为A_500(H-A);最好测量三次取平均值；

B． 在比色杯中加入100uL待测的生物素标记蛋白（Biotinylated Protein,简称BP），充分混匀后，在500nm波长测量吸光值，吸光值稳定20秒以上，记录为A_500(H-A-BP);最好测量三次取平均值；如果A_500(H-A-BP)<0.35,请用PBS稀释待测样品，再次重复此步骤。

微孔酶标板法：

A.      取180uL HABA- Avidin混合液放入微孔板中，在500nm波长测量吸光值，记录为A_500(H-A);最好测量三次取平均值；

B.      在微孔板中加入20uL待测的生物素标记蛋白（Biotinylated Protein,简称BP），震荡或移液器吹打充分混匀后，在500nm波长测量吸光值，吸光值稳定20秒以上，记录为A_500(H-A-BP);最好测量三次取平均值；如果A_500(H-A-BP)< 0.3*A_500(H-A),请用PBS稀释待测样品，再次重复此步骤。

案例演示：

以Frdbio超级生物标记试剂盒（货号：ARL0021SK）标记Anti-Covid-19 Spike Mab (货号：nCoV-S-hMab-B)，标记后测算标记比，分光光度计法。

本案例中被标记蛋白为抗体，分子量（MW）为150,000,浓度为5.0mg/mL，A_500(H-A)=1.090，A_500(H-A-BP)=0.585，

抗体摩尔浓度计算：mM /mL=5/150000=3.33*10^-5

ΔA₅₀₀=（0.9*1.090）- 0.585=0.396

生物素摩尔浓度计算：mM /mL=0.396/(34000*1)=1.16*10^-5

抗体：生物素（摩尔比）=(3.33*10^-5)/(1.16*10^-5*10)=1:3.48