1．包装清单：

2．保存条件：本产品-20℃保存，一年有效。

3．产品简介：

细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。约90min就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。本试剂盒可以抽提100个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约60mg组织。

4．使用说明：

A．准备溶液：

室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。

B．对于贴壁细胞：

用PBS洗一遍，用移液器吹落细胞，或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹落细胞。离心收集细胞，吸尽上清，留下细胞沉淀备用。根据细胞类型使用不同消化酶处理细胞。

C．对于悬浮细胞：

1)        用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽量吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

2)        每20 μl细胞沉淀加入200 μl添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。(对于二百万Hela细胞，其细胞沉淀的体积大约为20 μl或40 mg)

3)        最高速剧烈震荡5 s，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长震荡时间)

4)        冰浴10-15 min。

5)        加入细胞浆蛋白抽提试剂B10μl。最高速剧烈震荡5 s，冰浴1 min。

6)        最高速剧烈震荡5 s，4℃ 12000-16000g离心5 min。

7)        立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。(可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀)

8)        对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50μl添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。)

9)        最高速剧烈震荡15-30 s，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2 min再高速剧烈震荡15-30 s，共30 min。

10)     4℃ 12000-16000 g离心10 min。

11)     吸取上清至预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-80℃冻存。

D．对于新鲜组织：

1)        把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B(例如200 μl细胞浆蛋白抽提试剂A中加入10 μl抽提试剂B)。并加入PMSF至最终浓度为1 mM配制成组织匀浆液。按照每60 mg组织加入200 μl组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4℃进行。

2)        匀浆后把匀浆液转移到离心管内，冰浴放置15 min。

3)        4℃ 1500 g离心5 min。把上清转移至一预冷的塑料管中，为抽提得到的部分细胞浆蛋白。(吸上清时千万不要触及沉淀)

4)        沉淀重复步骤1-3开始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤3中抽提得到的细胞浆蛋白合并。

5．注意事项：

1)        需自备PMSF。建议在临用前加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。PMSF(WBR0114)可以向我 公司订购。

2)        抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。

3)        本试剂盒对于组织样品，可以抽提的组织样品数通常不足100个。使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用我们生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(WBR0201)测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。

4)        为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

*本试剂仅供实验室研究使用