多克隆抗体制备——抗体效价的检测（ELISA）

通过间接ELISA法来确定抗原最佳包被浓度 (方阵滴定，也叫棋盘滴定法) 。下面以兔高免血清多抗效价检测为例

1. 抗原用包被缓冲液CBS (0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)按1μg/ml浓度用作连续1:2倍比稀释，每个稀释度包被一行（12孔/行）,100μl/孔加入酶标板中，覆膜密封（防止水分挥发）4℃包被过夜(12h以上)。

2. 次日甩掉板中液体，在吸水纸上拍干板子，每孔加入150μl封闭液(含2% BSA的包被缓冲液CBS），室温（25℃） 2h以上。

3. 用洗涤液PBST[含0.05% Tween-20的PBS(pH7.4)]洗板3次，此时将待测高免阳性血清和空白阴性血清用抗体稀释液（含1% BSA的PBS缓冲液,pH7.4）分别从1:500开始做连续1:2倍比稀释，按下图分布模式100μl/孔，37℃ 1h。

4. 取出拍干，洗涤液洗板3次，每孔加入100μl二抗工作液（用抗体稀释液1:3000稀释HRP标记羊抗兔IgG，Frdbio，Cat No.:SAB90200H）,37℃孵育1h。

5. 取出拍干，洗涤液洗板3次，每孔加入100μl单组份TMB底物（Frdbio,Cat No.:ELS0010），室温孵育5～20min（根据颜色的改变速度）。

6. 每孔加入50μl终止液（0.5M H2SO4）。

7. 在酶标仪上读取450nm/630nm的吸光度。

标准的结果分布模式应该如上图所示： ELISA酶标板显色由阴阳性区域第一行第一列孔向外显均匀放射状递减；如果在包被梯度方向上OD450过高无梯度，应该继续降低包被浓度；反之，则增加。同理，如果在免疫血清稀释度方向上OD450过高无梯度，则应继续加大稀释度，反之，则减小。

8. 最佳包被浓度的确定:

阳性血清区域内某个孔对应的OD值与其上/其左孔OD值恰好为2倍关系且OD值不低于1.2,且此孔对应的阴性血清区域OD值与空白对照孔OD值无差异，此孔包被的抗原浓度的2倍确定为抗原的最佳包被浓度。同理也可以参照此方法确定阳性血清的最佳稀释倍数。

如果方阵滴定的数值结果不能如图分布，则需要重新设计方阵实验。

9. 以最佳包被浓度将抗原按照上述方法包被到酶标板同时封闭，将阴性/阳性血清依次倍比稀释，100μl加到酶标板孔（最好做复孔），然后依次加入二抗、底物显色，读取OD值。

对应稀释度阴性血清OD值的2.1倍确定为阳性值，也称Cut-off值，这个是检验学上的常用方法，而往往制备抗体的高免血清的稀释度都比较高，其对应稀释度的阴性血清值接近于空白值，所以这个判断方法作为ELISA稀释终点没有意义，Frdbio定义ELISA终点方法为：OD值-空白值或阴性对照值≧0.100（前提条件是空白孔值/阴性对照孔OD值﹤0.050），可以根据自己的实验室具体情况自己确定合适的终点判定标准。