重组表达质粒的构建——基因的克隆

长片段基因在大肠杆菌中表达往往比较困难，作为抗原使用的重组蛋白可以考虑选择抗原性好的区段原核表达，前文已作阐述。对整个蛋白结构研究，必须全长表达该蛋白，此时最好考虑真核表达系统，特别是含有跨膜区的蛋白。

选定要克隆的区段，需先富集纯化之后才方便插入载体，常用的富集方法是PCR或者质粒繁殖复制。为了防止在PCR扩增过程中引入碱基错误或者碱基缺失，PCR扩增基因时候必须使用高保真Taq酶。为了满足科研工作者不同实验需求，福因德生物将高保真Taq酶优化为即用型Mix，使用时直接加引物和模板就可以扩增。 除此之外，福因德生物还开发出LA Taq、S-Taq Mix 以及SYBR荧光定量PCR Mix(需要更高品质的可选用SYBR PCR SuperMix)。

原核重组表达常用克隆技术主要有以下几种：

1. 酶切连接

这个是目前应用最为广泛的的克隆技术，主要优点是技术稳定；缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的成败。如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，比如，批量克隆基因到某个载体上，可一次性大量双酶切将载体线性化后保存备用，每次构建载体只需酶切外源基因片段，载体可直接取用，不必每次都酶切，省时省力（此处需特别留意的是基因内部不能有与上述所用冲突的酶切位点）。

2. TA克隆

TA克隆必须使用商业的线性化载体，线性载体3´末端有一个T碱基，与PCR扩增产物3´末端A正好匹配。这种克隆策略最大的优点是载体使用方便，扩增产物可以直接克隆到载体上，不需要酶切位点等冗余序列；缺点是：必须依赖商业化载体，载体选择受限；扩增外源片段所使用的Taq酶也必须是可以在3´末端加A，这种Taq酶的保真度不高；外源片段插入之后还必须鉴定方向。目前，这种构建表达载体的策略已经逐渐被淘汰。

3. TOPO克隆

TOPO克隆载体利用DNA拓扑异构酶I识别序列中的CCCTT松弛双螺旋并重新连接，同时兼具限制性内切酶和连接酶的功能。主要原理是在T载体的T碱基上共价偶联一个DNA拓扑异构酶I分子，其克隆效率提高数倍，并且操作极其简单，整个反应体系不需要在添加连接酶成分。如果在线性化平端载体上共价偶联一个DNA拓扑异构酶I分子，平端连接将不再是难题，如果再配合一个致死基因ccdB （Control of cell death）使用，凡是没有插入外源核酸序列的空载体自连，转入大肠杆菌可以正常表达ccdB蛋白，破坏细菌DNA gyrase(促旋酶)，造成细菌染色体降解而死亡；而插入外源核酸序列的会干扰ccdB蛋白的正常表达，细菌可以正常存活，平端克隆高背景问题这样得以完美解决。

4. Gateway技术

该技术所依赖的基础是lambda噬菌体的位点特异性重组反应。需要限制酶切回收、T4 Ligase连接；该方法一步就可以完成，只需要将基因克隆到入门载体（Entry Vector）,依赖载体上的特定的重组序列和重组酶，将外源基因克隆到具有相同重组序列的载体上；入门载体一般包含两个attL1和attL2,中间夹杂一个ccdB自杀基因，自连的空载体在转入大肠杆菌中都不会存活。入门载体构建成功之后，就可以轻松地将入门载体和目的载体质粒混合加入重组酶即可发生重组，生成所需要的融合质粒，当然还有一个副产品质粒。这种克隆方法适合于将一个基因批量化构建到不同载体系列中进行功能测试。这种技术也适合于大批量的文库构建，具体细节在此就不做赘述。

该技术主要的缺点是：该技术系统使用的酶非常昂贵，而且酶非常不稳定；其次，适合于gateway技术的载体非常少，只有一个厂家生产而且昂贵，来源受限；对于大片度（>10Kb）的效率很低，与传统的酶切-T4连接技术相比没有优势。

5. Infusion技术

这个是目前比较流行的克隆技术，可以任意载体任意基因片段快速实现多片段、长片段定点定向克隆，最大的优点在于不依赖于酶切位点进行克隆，操作时间也非常短，只需要10～15min；缺点是：载体和外源片段连接处的重叠15bp必须坚持末端原则，不能“甩出”，这也限制了定点克隆的“任意发挥”。

6. Frdbio SimpleClone技术

本克隆技术是在福因德生物基础团队在Infusion技术上的升级，除了兼具Infusion技术的全部优势外，还具有以下特点：克隆片段重叠区可以少于15bp,最短可以至10bp,反应温度50℃，载体线性化之后，重叠区可不必末端对齐，可以“允许末端甩出”，实现真正意义上的任意位点克隆。

下面介绍两种比较常用的构建方式：

A 酶切连接法构建载体

1）50 μl酶切体系: PCR回收产物 /载体～2μg,限制性内切酶A 1μl (10U), 限制性内切酶B 1μl (10U),双酶切Buffer 5μl，H2O补充至50μl；37℃ 连接4～6h。

2）10 μl连接体系: 酶切PCR回收产物与酶切线性化载体摩尔比为10:1，Ligase 0.5μl，10*Ligase Buffer 1μl, H2O补足至10μl（体系中线性化载体浓度不低于10ng/μl），16℃ 连接过夜。

连接产物可用于转化大肠杆菌。

B Simpleclone重组酶法构建载体

1）载体线性化：

   载体线性化同上文“SOP3酶切连接法构建载体”。

2）外源片段的获得：参照Simpleclone重组酶说明书设计引物并扩增获得，保证两端分别与线性化载体末端有15nt重叠区。

3）反应体系的配制(10μl)：

实验组：线性化载体 50ng，外源插入片段50ng，5×Simpleclone重组连接反应液 2μl，补足水至10μl；

阴性对照组：线性化载体 50ng，外源插入片段50ng，补足水至10μl；

阳性对照组：线性化载体pUC19 Control Vector20 ng，外源插入片段2 kb Control Insert fragment 50ng，5×Simpleclone重组连接反应液 2μl，补足水至10 μl ；

4）将以上体系配置好在PCR管底部（阴性对照和阳性对照实验可选做），配好后放在PCR仪上或水浴锅中50℃ 15min。