抗体的标记——辣根过氧化物酶（HRP）

抗体可以通过不同的化学试剂交联到酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶）、荧光染料（FITC、PE、APC等）、生物素（Biotin）、胶体金等。抗体标记HRP最为经典的方法为NaIO4氧化法，先将HRP糖基氧化成醛基，醛基与抗体的-NH2反应生成希夫氏碱反应，抗体分子与HRP分子形成稳定结构。标记的时候一般按照抗体分子与HRP分子摩尔比1:4的比例进行标记，此时,两者的质量约为1:1。

1. 抗体/蛋白的HRP标记（NaIO4氧化法）

标记以2mg抗体为例。

1.1 抗体/蛋白的处理

待标记抗体/蛋白在50mM碳酸盐缓冲液 (0.015M Na2CO3，0.035M NaHCO3，pH9.6) 中透析，其间换液2次，抗体/蛋白浓度调整为2mg/ml；或者将高浓度的抗体用0.5M碳酸盐缓冲液(0.15M Na2CO3,0.35M NaHCO3 ,pH9.6)稀释到2mg/ml，如果原抗体/蛋白溶液中含有Tris、NH4+等游离氨基的试剂，必须透析除去。

1.2 HRP酶的氧化

1.2.1 称取2mg HRP干粉(Frdbio)溶于100 μL ddH2O 中。

1.2.2 称取 NaIO4 21mg，溶于1 mL的ddH2O中，吸取100μL NaIO4溶液与100μL的HRP溶液缓慢混合，4℃下静置 30min，此时溶液为绿色。

（注意：此后的操作均在避光条件下进行。）

1.2.3 吸取２µL乙二醇缓慢加入氧化后的HRP溶液，室温避光静置 30min，此时溶液为褐色。

1.3 抗体的标记

1.3.1 将氧化好的HRP溶液直接加入到已处理好的抗体/蛋白溶液中，室温反应２h。

1.3.2 称取0.4mg的NaBH4，溶解于20µL的 ddH2O中，全部加入上步反应液中，4℃静置 2h，每30min摇动一次。

1.3.3 PBS(pH7.2)透析过夜，标记液中加入体积比30%～50%的甘油，混匀后置于-20℃保存。

2. 抗体/蛋白的HRP标记（戊二醛法）

参照多肽与载体偶联相关“三种不同多肽与载体偶联的方式——Frdbio GA(Glutaraldehyde,戊二醛)介导多肽与载体偶联”。