福因德科技抗体纯化标准流程（SOP)

抗体纯化分为三级：

A:初级纯化：(NH4)2SO4或辛酸

B:中级纯化：广谱Protein A ，Protein G

C:高级纯化：抗原配体特异性纯化

所需溶液：1mM HCl，PBS

A.饱和硫酸铵配制：无菌去离子水加入足量硫酸铵之后，加热到65℃以上，在磁力搅拌器上搅拌溶解到底部仍有未溶解的硫酸铵，待冷却后，取上清滤纸过滤。

B.BaCl2：0.02M/L

C.偶联缓冲液：0.5M NaCl，0.1M NaHCO3，pH8.3-8.5

D.封闭缓冲液：1）1M乙醇铵     2）0.2M甘氨酸（pH8.0）

E.乙酸盐缓冲液：含0.5M NaCl的0.1M 醋酸，pH4

F.20%乙醇（PBS中）0.02%NaN3

1.初级纯化(NH₄)₂SO₄

1）饱和硫酸根配制和NH4+

2）透析后硫酸根和NH4+检测

2.中级纯化

抗血清的亲和纯化（Protein A∕ Protein G）

所需溶液：

A.0.1M  Gly-HCl（pH2.7）[洗脱液]

B.0.5M  Tris-Cl（pH8.0）[中和液]

C.PBS（pH 7.2）

D. 20%乙醇（20%乙醇in PBS）0.02%NaN3[保存液]

1）血清预处理： 0.22孔径滤器过滤血清，与等体积PBS混合，调至pH7.8，此时亲和挂柱效果较好。

2）平衡亲和柱，用10倍体积的PBS清洗柱子，同时将柱子下端与核酸蛋白检测仪进液口连接，并固定。

3）上样：PBS平衡柱体时，调节核酸蛋白检测仪数值稳定在0左右，将样品加入上样柱床，核酸蛋白检测仪上数值慢慢升高，收集液体（此液体简称流穿液，流穿液中可能还会有未被柱子抓取的抗体，所以暂时收集以再次过柱纯化使用），当核酸蛋白检测仪的数值下降到平衡数值，不再下降时，停止收集流穿液。

4）抗体洗脱：当核酸蛋白检测仪的数值保持较低数值并稳定时，待柱床液面快流干时，轻轻在柱床上加入洗脱液（尽量不要冲起柱床）；当核酸蛋白检测仪上数值迅速升高时，迅速承接洗脱的液体，并迅速用中和液中和，承接时宜多管顺次接取，并记录顺序。

5）洗脱完毕后，当数值变低并不再变动，柱子用至少5倍体积的PBS 2-4 ml/min流速清洗平衡。

6）用保存液（20%的乙醇）封闭柱子上下两端，4 ℃保存。

3.高级纯化（自制配体抗原亲和柱）

3.配体的抗原特异性亲和纯化

1.亲和柱的制备

1）称取0.3 g溴化氰活化的琼脂糖凝胶（1:3溶涨GE产品货号27-0430-1）加入1mmol/L盐酸中，常温搅拌至少30分钟（或者4℃过夜使其充分溶涨），可以获得1ml溶涨胶。

2）将凝胶转移入纯化柱中，用约30ml 1mmol/L的盐酸抽滤介质3次，[抽滤去除内部空气气泡]。

3）用5-10倍体积的超纯水清洗介质一遍，（留1-2倍体积超纯水将凝胶重悬起来）。

4）将待偶联配体用偶联缓冲液溶解成2mg/ml浓度

5）将重悬的凝胶与偶联配体液迅速混合，室温（25℃）反应2小时以上，期间不断摇动，使其充分偶联反应。

6）偶联结束，取上清液检测是否还有游离未偶联的配体（蛋白或抗体），检测方法：用分光光度计直接检测计算，如果溶液中配体行亮＞0.2mg/mL，说明偶联饱和；否则需加入配体重复第4）第5）步。（一般1ml凝胶可以偶联10mg蛋白配体）

7）封闭：确认偶联完全后，取 15ml封闭缓冲液（1M 乙醇胺或者0.2M 甘氨酸pH8.0）室温(25℃)孵育2小时或4 ℃过夜。

8）交替使用20ml的偶联缓冲液和20ml的乙酸盐缓冲液洗凝胶柱4次。

9）亲和柱制备好后，用PBS平衡后即可用于抗体纯化。

10）如若暂不使用，用20%的乙醇保存（或含0.02% NaN3的PBS）。

2.用自制配体抗原亲和柱纯化（其纯化方法与中级纯化方法相同）

3.抗体纯化的后处理

抗体纯化完后，要将其缓冲液置换成PBS，便于后期标记成其他用途使用，如果浓度太低，需要浓缩。

透析浓缩方法：

A.透析袋浓缩—不要用蔗糖浓缩

将纯化的抗体装入透析袋中，透析袋表面覆满PEG20000进行浓缩

B.超滤管浓缩

将纯化的抗体转入15 ml的超滤管，3500g离心12分钟左右（根据要浓缩的体积摸索离心时间）。

抗体浓度测定：

取适量抗体检测OD280nm的吸光度，读数不要超过2。如果读数超过2，再稀释，用吸光度读数除以1.35，再乘以稀释倍数即为抗体的大致浓度。抗体的浓度也可以用（OD280nm-0.35×OD495nm）/1.4这个公式计算。浓缩抗体浓度最好不要太高，太高容易引起沉淀。