单克隆抗体制备——细胞融合

 1．实验必备（以下器材/试剂必须全部准备齐全才可以开始操作）

2．试剂配制

2.1 实验前取PEG1450 1ml于无菌EP管37℃预温；

2.2 HAT完全培养基：20%胎牛血清+1%双抗(链霉素和青霉素)+1/50体积的HAT（50×）+1640不完全培养基，按每块96孔板20ml配制，于37℃预温；

2.3 分取50ml 1640不完全培养基37℃预温（融合后稀释PEG用）。

3．实验前准备工作：

实验前将实验要用到的离心管、离心管架、剪子、镊子、匀浆器、细胞筛网、培养皿、固定板等放入超净台，紫外照射30min左右。

4．饲养细胞/融合细胞准备

4.1 饲养细胞的制备（可在融合前一天完成，亦可当天制备）：

4.1.1 取空白Balb/c小鼠，眼球取血处死，将其浸入75%乙醇中5min，并且用镊子将其夹住在乙醇中不时搅动使其充分消毒。

4.1.2 将灭过菌的滤纸铺在固定板上（内面朝上），用镊子将老鼠从75%酒精中取出，沥干酒精。

4.1.3 取无菌固定针头将老鼠侧卧固定（身体左侧向上）在固定板上。

4.1.4 用灭菌镊子轻轻拉起老鼠的腹部皮肤，用灭菌剪刀从下往上剪开一道口子，沿口子将老鼠的皮肤撕开，将其固定（注意：老鼠外侧皮毛不要接触内部）。

4.1.5 取10ml 1640不完全培养基在干净的灭菌玻璃培养皿里， 10ml注射器吸取5ml培养基，用一个灭菌镊子轻轻提起老鼠的腹膜，将5ml培养基打入老鼠腹部，同时轻轻按摩老鼠的腹部1min后，将培养基回收，置于50ml无菌离心管中，再次吸取5ml培养基，可重复此步骤多次（此步为取腹腔细胞步骤，如不需则省略）。

4.1.6 取3～5ml 1640不完全培养基放入匀浆器中，用剪刀和镊子，将鼠腹腔剖开，取出其左侧的脾脏剪去表面脂肪，放进匀浆器中轻轻研磨。

4.1.7将研磨的液体通过细胞筛网过滤掉块状物。

4.1.8取3～5ml培养基冲洗匀浆器，再次过筛网。

4.1.9将细胞筛网过滤的液体吸入干净的50ml无菌离心管中，若取了腹腔细胞可合并置于50ml无菌离心管中，加1640不完全培养基至30ml，离心1,500rpm，5min，弃上清。

4.1.10将沉淀重悬于HAT完全培养基，此时饲养细胞已制备好，可按105/孔使用，于融合前一天铺板105个/100μl/孔，亦可当天随融合细胞混合铺板。

4.2 免疫脾细胞制备：

4.2.1 取免疫Balb/c小鼠，眼球取血处死，将其浸入75%乙醇中5min，并且用镊子将其夹住在75%乙醇中不时搅动使其充分消毒；

4.2.2将灭过菌的滤纸铺在固定板上（内面朝上），用将老鼠从75%酒精中取出，沥干酒精。

4.2.3 取无菌固定针头将老鼠侧卧固定（身体左侧向上）在固定板上。

4.2.4 用灭菌镊子轻轻拉起老鼠的腹部皮肤，用灭菌剪刀从下往上剪开一道口子，沿口子将老鼠的皮肤撕开，将其固定（注意：老鼠外侧皮毛不要接触内部）。

4.2.5 取3～5ml 1640不完全培养基放入匀浆器中，用剪刀和镊子，将鼠腹腔剖开，取出其左侧的脾脏剪去表面脂肪，放进匀浆器中轻轻研磨。

4.2.6 将研磨的液体通过细胞筛网过滤掉块状物。

4.2.7 取3～5ml 1640不完全培养基冲洗匀浆器，再次过筛网。

4.2.8将细胞筛网过滤的液体吸入干净的50ml无菌离心管中，置于50ml无菌离心管中，加1640不完全培养基至30ml，离心1,500rpm，5min，弃上清，1640不完全培养基重悬细胞沉淀，备用。

4.3 SP2/0细胞制备：

若SP2/0为培养细胞，直接吹打悬浮起来后离心即可计数使用；若为实体瘤SP2/0，按以下步骤操作：

4.3.1 取背部花生米大小实体瘤的Balb/c小鼠，眼球取血处死，将其浸入75%乙醇中5min，并且用镊子将其夹住在乙醇中搅动使其充分消毒。

4.3.2 将灭过菌的滤纸铺在固定板上（内面朝上），用镊子将老鼠从75%酒精中取出，沥干酒精。

4.3.3 取无菌固定针头将老鼠俯卧固定（身体背侧向上）在固定板上。

4.3.4 用灭菌镊子轻轻拉起老鼠的背部近尾侧皮肤，用灭菌剪刀从下往上剪开一道口子，沿口子将老鼠的皮肤撕开，将其固定（注意：老鼠外侧皮毛不要接触内部）。

4.3.5 用镊子和剪刀剪下实体瘤（实体瘤以均匀棕白色，质地松软不液化为宜，液化部分多为死细胞）放入匀浆器中加入3～5ml1640不完全培养基研磨。

4.3.6 将研磨的液体通过细胞筛网过滤掉块状物。

4.3.7 取3～5ml 1640不完全培养基冲洗匀浆器，再次过筛网。

4.3.8 将经过细胞筛网过滤的液体吸入干净的50ml无菌离心管中，加培养基至30ml离心1,500rpm，5min，弃上清，1640不完全培养基重悬细胞沉淀，备用。

（以上4.1 、4.2 、4.3 三个步骤可以同时进行，融合时细胞离体时间越短其融合效果越好。）

5．融合操作步骤

5.1 用1640不完全培养基将SP2/0细胞和免疫鼠脾细胞重悬，分别用血球计数板计数，按脾细胞：SP2/0细胞=1:3比例于50ml无菌离心管中混合，充分混合后加1640不完全培养基至40ml；

5.2 离心1,500rpm 5min 。

（此时准备37℃的温水用于细胞融合离心管的温育。）

5.3 离心后弃上清以及管壁液体（可用灭菌吸水纸条吸干），轻轻敲打SP2/0细胞和免疫鼠细胞混合沉淀使其松动，将离心管底部浸入37℃温水中。

5.4 从培养箱中取出已温育的1ml融合剂PEG1450，60s内均匀滴入细胞混合沉淀中（边滴加边转动离心管）。

5.5 静置温育45s，取出37℃温箱中预热的1640不完全培养基，取1ml，60s均匀滴入沉淀中稀释PEG融合剂（边滴加边转动离心管），再取1ml，30s内均匀滴入，之后将剩余的45ml培养基全部慢慢滴入。

（注意：不要用力冲击！此步骤为稀释融合剂。）

5.6 轻轻颠倒混匀后，离心1,500rpm 5min，弃上清。

5.7 用含有饲养细胞和HAT完全培养基溶液200ml重悬细胞沉淀；若饲养细胞已提前铺板，则只需用100ml的HAT完全培养基溶液重悬。

（饲养细胞是一把双刃剑,可以辅助融合杂交瘤细胞生长,但是对于入门新手来说,如果操作不当除了增加污染的风险外,还可能由于使用量太少达不到辅助作用,或者使用量太大,与融合细胞争夺营养,对融合造成毁灭性破坏。）

福因德生物通过研究杂交瘤细胞生长的规律,发现对杂交瘤细胞生长促进作用最为显著的是IL-6,EGF等，通过调配这些生长因子的比例和浓度，研发出杂交瘤细胞培养添加剂，使杂交瘤细胞处于最优生长环境，单抗初学者可以选择此产品，使用此产品后无需再添加饲养细胞，细胞融合后长出的细胞集落均匀，细胞孔背景干净。