单克隆抗体制备——融合细胞的培养与筛选

1. 杂交瘤融合细胞铺板培养

1.1 96孔板液体培养

1.1.1用排枪将重悬后的细胞均匀铺入96细胞培养板，200μl/孔（若饲养细胞已提前铺好，则只需每孔加100μl即可）；

1.1.2铺好后置5% CO2，37℃培养箱培养，培养7天后，用HAT完全培养基换液一半。

1.2半固体培养基培养

1.2.1 取2%甲基纤维半固体培养基（1×1640不完全培养基+1×HAT+1%双抗+20%胎牛血清）20ml，加入20ml融合细胞和饲养细胞悬液（HAT完全培养基），再加入2ml促进杂交瘤形成添加物因子，充分混匀后，倒入6孔板，3ml/孔；

1.2.2 6孔板置5% CO2，37℃培养箱培养，长出白色集落，挑取白色集落至含饲养细胞的96孔板中。

2. 杂交瘤阳性细胞孔的筛选

阳性细胞孔的筛选一般采用间接ELISA法。

2.1 抗原最佳包被浓度的确定

参照“多克隆抗体制备——抗体效价的检测（ELISA）”

（在进行杂交瘤细胞检测之前必须用阳性免疫血清建立好ELISA检测方法。）

2.2 杂交瘤细胞孔的检测

按照最佳包被浓度包被ELISA板，封板后，取杂交瘤细胞细胞培养上清，加入酶标板孔，每孔100μl；孵育洗涤后，分别加入HRP标记羊抗小鼠，底物显色，读取OD值。

2.3 阳性细胞株/阳性孔的选取

选取阳性值最高的孔予以保留并进行亚克隆。

（具体该选择保留多少孔根据项目实际需求决定。）