多克隆抗体制备——动物免疫

动物的免疫是制备抗体最为重要的环节之一，物种选择上最好选择与抗原物种远亲缘动物为宜。下表列出常规抗原在不同动物上的使用剂量和免疫程序。

程序和剂量：以蛋白类抗原为例（一般免疫间隔为3周，如果比较急，也可间隔2周免疫一次）

1.动物的准备及背景测试

选取健康符合实验动物标准的动物，免疫前需要静养一周，免疫前采血进行背景测试。

1.2 兔耳静脉取血方法

耳静脉取2ml血，如果耳静脉不明朗，可擦拭二甲苯，一般来说取1ml以上是足够做背景测试用的。

1.2.1 将兔子固定在固定盒内，轻轻抚摸背部使其安静下来。

1.2.2 用75%酒精棉擦拭兔耳朵，使其耳静脉可见，必要时可用刮刀刮净兔耳上的毛，如果血管依然不明显可用二甲苯擦拭，使其血管膨胀。

1.2.3 用5ml注射器针头平行插入耳静脉，轻轻回吸（吸的太快，静脉不能及时回血，血管会堵塞针头），血液缓冲进入注射器管腔。

1.2.4 迅速将注射器中的血液注入离心管，37 ℃放置1h，4 ℃过夜血清析出。

1.2.5 将血清析出的离心管于4 ℃，10,000rpm离心10min，收集上清，即为血清，短期不使用，需加入0.02%NaN3，-20℃保存。

1.3 大小鼠眼眶取血方法

1.3.1 将大/小鼠按压在鼠笼上，拇指、食指和中指联合固定其头部。

1.3.2 紧握颈部，压迫颈部两侧使眼突出，眶后静脉丛充血。

1.3.3 右手持毛细管从眼内眦（zì） 部，与书面成45°夹角旋转刺入。

1.3.4 固定身体，压住后肢，放松手指，调整毛细管，使血流顺畅，离心管接收。

1.3.5 取血完毕，放松颈部压力，拔出毛细管，干棉球按压止血。

1.3.6 离心管，37 ℃放置1h，4 ℃过夜血清析出。

1.3.7 将血清析出的离心管于4 ℃，10,000rpm离心10min，收集上清，即为血清，短期不使用，需加入0.02%NaN3，-20℃保存。

2. 背景测试：方法见ELISA效价测定方法。

3. 免疫抗原准备（抗原乳化）

3.1 抗原溶解在灭菌的0.85% NaCl溶液或PBS（pH7.2）中,体积为250μl/只兔子为宜，抗原总量根据抗原性质不同而异，蛋白抗原以100μg/只兔子为宜，多肽和小分子抗原需加大剂量，最多不超过500μg为宜。

3.2 加入等体积佐剂乳化（除首次使用弗氏完全佐剂外，以后全部用弗氏不完全佐剂。完全佐剂使用时，一定要将底部橘黄色沉淀搅起）；乳化可用双注射器反复推动，也可用银汞调合器或超声波乳化。

（判断乳化是否成功方法：取一滴乳化液滴在水面上，以不迅速扩散为宜，乳化好的抗原总量应该为400～500μl/只兔子左右。乳化不宜过度，否则注射动物体内难于释放抗原，反而不利于抗体产生。）

3.3 乳化的过程中，由于乳化状态的抗原粘度粘壁，会有部分的抗原损失，剂量和体积越小相对损失越多，所以对于微量珍贵佐剂尽可能选用水溶性佐剂。

（快速免疫佐剂：为了快速获得高免血清或者抗体，可以使用Frdbio快速水溶性佐剂，对于不适合乳化或者微量抗原的比较适合。）

4. 动物注射免疫

4.1 小心从笼中取出兔子，固定在固定架上，轻抚背部使其安静。

4.2 用75%酒精棉球擦拭消毒，将背部免疫部位皮肤提起，针头与皮肤呈15°角插入皮下1～2 cm，注射完后稍微停留10秒左右，以防抗原外流。

（注射宜采用多点注射，免疫背部皮下、颈部皮下或腹股沟淋巴结等，免疫点越多越好。）

4.3 每次免疫前耳静脉取血测定效价（测定方法见下文ELISA方法），效价为免疫后第10～14天测定值最高。

5. 鸡的选择和免疫

5.1 成年产蛋母鸡，即将产蛋的母鸡（鸡龄不宜太大，偏大的免疫效果不是很好）。

5.2 免疫途径：翅部肌肉注射免疫,免疫剂量与兔子相同或略低。

5.3 免疫间隔：0天，21天，35天，49天，63天。

5.4 蛋的收集：免疫结束后过10天收集蛋，可以收1个月左右，如果还需要收集，可以加强免疫 1次。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33432361/