产品简介：

单克隆抗体序列可变区获取和序列测定是基因工程抗体的必备技能，但是由于抗体基因序列5’-端复杂性和多样性，往往获取可变区序列比较困难，5’-RACE虽然可以实现，但是成本高，操作复杂，由于抗体序列的复杂性和SP20基因组干扰序列太多，RACE往往不是最优的手段；本试剂盒通过优化设计采用高效引物Mix组合覆盖，可以快速简便扩增出抗体基因可变区序列，扩增序列之后连到T载体，通过简单测序，可以快速得到抗体可变区序列，后期用于基因工程抗体的改造表达。

本试剂盒的优势：

1.   操作时间短，如果操作顺利，3-5工作日内可以获取到抗体可变区序列；

2.   本试剂盒操作简单，具备基本分子生物学操作基础的人可以轻松入手实现操作；

3.   本试剂盒可以剔除和降低基因组或者相似序列对序列准确度的影响；

4.   实验室内实现抗体基因测序，成本更低：目前委托技术服务公司进行杂交瘤测序费用较高；

5.   实验室内实现抗体基因测序，更有利于抗体序列的核心知识产权和专利的保护。

特别注意事项：

1.   本试剂盒适用于单抗轻链为Kappa亚型细胞株，如果轻链Lammda请联系购买另外产品。

2.   本试剂盒的操作人员必须熟练掌握分子生物学相关实验操作技能，包括mRNA提取，反转录，PCR扩增， PCR产物胶回收，T载体连接，大肠杆菌转化，菌落PCR鉴定 ，以及测序结果的识读和序列比对等技能；

3.   实验室必须具备开展以上实验所必须的实验仪器和实验条件；

4.   实验室必须具备开展以上实验所必须的高性能试剂；

5.   务必保证杂交瘤细胞株为单克隆，状态好，传代培养越少越好；

6.   实验室环境必须洁净，实验人员操作规范，避免交叉污染。

试剂盒组分

产品使用：

本产品操作流程包括以下环节：mRNA提取→反转录→1^st PCR和2^ndPCR扩增→PCR产物胶回收→T载体连接→大肠杆菌转化→菌落PCR鉴定→测序结果识读→序列比对/抗体序列分析→抗体重组表达

1.实验准备

1）为确保实验能够顺利开展，您必须具备试剂盒操作流程各环节技能:

2）必备仪器：PCR仪，水平电泳仪，高速离心机

3）其他需要您准备的试剂：RNA提取试剂盒/Trizol试剂(氯仿，75% 乙醇，无RNase ddH₂O, 异丙醇)，T-载体连接试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，ddH₂O(无RNase）等

4）必备耗材：吸头/EP管(无RNase）

2.实验操作

1）杂交瘤细胞mRNA提取

（1）培养杂交瘤细胞

首先确保你的杂交瘤细胞株是单克隆，杂交瘤细胞株培养至细胞数约 1×10⁵-1×10⁶（大约24孔培养板1-2个孔细胞长满）时，将细胞吹起重悬，1500rpm x 5min， 离心收集细胞；同时收集细胞培养上清用于鉴定单克隆抗体杂交瘤细胞分泌抗体的亚型。（细胞株不纯，可能获取到多条干扰或重链或轻链）

（2）单抗亚型及轻链测定（可选）

步骤1收集的细胞培养上清，通过ELISA方法测定抗体亚型（如果之前已经完成亚型和轻链鉴定,此处不必再测），亚型测定不方便的可以购买我们的亚型测定试剂盒。

（3）杂交瘤细胞mRNA的提取

以下步骤仅供参考，强烈建议:使用高品质RNA提取试剂盒并消化掉基因组DNA

1步骤（1）得到细胞离心沉淀，尽量吸干残余液体；在超净工作台环境，加入1ml Trizol试剂使其裂解，静置5min；

2加入200uL氯仿，剧烈震荡30秒，室温静置3min，12000 rpm  15 min；

3取上层水样层至新的EP管，加入等体积异丙醇，室温静置30分钟或-20℃ 放1∽2小时；

412000 rpm  10 min，弃上清，管底白色沉淀物即为RNA;

5加入1 mL 75% 乙醇重悬洗涤RNA，12000rpm  10 min，小心吸弃液体，超净台风干管底沉淀；

6加入50ul 无RNase ddH₂O复溶（如果难以溶解，请放在55℃至完全溶解），即得到mRNA,立即进行反转录步骤，或者-80℃保存备用。

2）RT反转录

上述步骤得到的mRNA立即进行cDNA反转录。

按照以下的配置体系进行操作

反转录得到的cDNA可以作为轻链和重链可变区的PCR扩增的模版，也可以保存于-20℃备用。

3）RCR扩增轻链kappa可变区（V_k）、重链可变区（V_H）

1^st PCR反应程序: 

94℃  5 min，（94℃ 30s,  46℃ 30s，72℃ 55s）X35循环，72℃延伸10min，4℃ hold 。

2^nd PCR反应程序: 

94℃  5 min，（94℃ 30s,  57℃ 30s，72℃ 55s）X35循环，72℃延伸10min，4℃ hold 。

4）PCR 产物鉴定及产物回收

PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，如果轻链可变区（V_k）得到扩增产物∽450bp,重链可变区（V_H）得到扩增产物为∽600bp，分别切胶回收PCR产物。

5）PCR胶回收产物的T载体连接

选用通用型T载体（连接平端PCR产物和带A尾巴PCR产物），按照操作说明进行连接；

6）连接产物转化DH5a感受态细胞

（1）连接产物(10ul)加入冰上解冻的100ul感受态细胞DH5a或TOP10；

(2) 42℃热击60-90秒,冰上冷却3-5min;

(3) 向离心管中加入1ml不含抗生素的LB培养基，轻轻混匀，置于37 ℃，220 rpm摇床振荡培养1小时，使细菌复壮；

(4) 4000rpm离心 2-3分钟，弃掉上清1ml，剩余100ul培养基重悬离心管底部菌体，将其涂布于含相应抗生素的筛选平板上；

(5) 将平板正面向上放在37℃培养箱1小时，待菌液完全被平板吸收后，倒扣平板放置37℃培养箱16-24小时。

7）连接产物初步鉴定

如果熟练掌握菌落PCR鉴定技术，可进行PCR菌落鉴定（载体上下游测序用引物对连接产物）。

常规方法：挑取平板上的菌斑，加入到2ml含有抗生素的培养基中220rpm培养摇床37 ℃培养至其浑浊，其1ul菌液进行PCR鉴定即可。

注意：

Ø   建议每个V_H（重链可变区）平板挑取10个菌斑培养并做PCR鉴定，建议每个V_k（kappa轻链可变区）平板挑取10个以上菌斑培养并做PCR鉴定；PCR鉴定引物为T载体测序的上下游引物；

Ø   PCR引物为载体测序的上下游引物，加上Primer SP20引物（1ul/50ul PCR体系）；PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，V_H电泳正确的结果为750bp左右；V_K电泳正确的结果应该为580bp左右，且没有250-300bp左右条带（下图红框内为SP2/0自身的kappa干扰序列）。

8）测序

PCR初步鉴定正确的菌液送去测序，测序引物为T载体对应的上下游引物（一般为M13F/M13R）。

9）测序结果分析及应用

返回的测序结果去掉T载体序列后，即为扩增得到的V_H和V_K序列，由于外源DNA片段插入T载体是没有方向性的，因此我们得到的可能是反向互补序列，需要将其转换过来。

通过NCBI数据库比对找到所得序列的CDS编码区，获取正确的读码框，翻译出对应的氨基酸序列；如果需要得到抗体全序列，可以与相应抗体亚型的保守区序列拼接，得到完整的抗体重链和轻链序列。