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Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL) 产品说明书
产品名称 | 产品货号 | 规格 |
Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μL) | Frd00031 | 100/1000 μL |
产品概述
牛痘病毒加帽酶是由D1和D12两个亚基组成，兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性。该酶作用于体外转录产物，在合适浓度的加帽缓冲液（Capping buffer），鸟苷三磷酸（GTP），S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等存在条件下，可将7-甲基鸟嘌呤帽结构（m7Gppp）连接到RNA的5'末端，形成帽子结构（m7Gppp5'N），该结构对于mRNA的稳定、转运和翻译过程具有重要作用。加帽反应在一小时之内完成，效率接近100%，并且保证正确的方向。
保存及运输条件
-30~-15℃保存，干冰运输。
产品基本信息
产品名称 | Vaccinia Capping Enzyme |
来源 | E.coli |
储存缓冲液 | 20mM Tris-HCl pH8.0; 100mM NaCl; 1mM DTT; 0.1mM EDTA; 0.1%TritonX-100; 50% (v/v) Glycerol |
加帽缓冲液（1X） | 50 mM Tris-HCl, pH 8.0; 5 mM KCl; 1 mM MgCl2; 1 mM DTT |
酶活定义 | 37℃条件下，1小时内将10 pmol GTP（α-32P）掺入到一条80个核苷酸（80 nt） 转录产物上所需要的酶量，即为1个单位。 |
产品应用
1、体内/体外翻译前mRNA的加帽反应。
2、mRNA的5'末端标记反应。
使用方法
加帽反应
1、取10 μg RNA于1.5 mL 离心管中，用RNase Free Water稀释至所需体积。
2、将稀释的RNA于65℃加热5 min使RNA变性。
3、冰上放置5 min。
4、按顺序加入以下各组分
组分 | 用量 |
Denatured RNA | 10 μg |
10 × Capping Buffer | 2 μL |
GTP (10 mM) | 1 μL |
SAM (2 mM) | 1 μL |
Vaccinia Capping Enzyme (10 U/μl) | 1 μL |
RNase Free Water | Up to 20 μL |
5、37℃反应30 min，加帽反应完成，可进行后续实验。
注意事项
1、用于加帽反应的RNA必须经过纯化并溶解于RNase Free Water。
2、反应前热处理RNA是为了打开5'末端的高级结构，热处理时间可根据高级结构的复杂程度调整。
3、建议在反应体系中加入1-2 μL的RNA酶抑制剂），以提高反应过程中RNA的稳定性。
4、SAM室温下不稳定，降解会导致加帽效率变低，因此，建议将SAM放在冰上。
5、如果加帽效率低，可以延长反应时间至1 h。
仅供科研实验使用
鄂公网安备：
