T7 High Yield RNA Transcription Kit使用说明书

产品描述                                                     

T7 High Yield Transcription Kit对体外转录体系进行了优化，能以带有T7启动子的线性化质粒、PCR产物或合成的DNA片段等为模板，在较短时间内通过体外转录反应获得大量RNA，操作简单便捷。

本试剂盒转录合成的RNA可用于体外翻译、显微注射、RNA保护实验、探针杂交、RNAi和RNA结构和功能研究等。试剂盒NTP是单独提供，便于根据自己需求，在底物中加入修饰的核苷酸，制备生物素或染料标记的RNA。

运输和保存

干冰运输，-20℃保存。

产品组分

产品用途

体外RNA合成

注意事项

1、为了避免RNase污染，实验中请穿实验服，戴一次性手套和口罩，使用RNase-Free耗材。

2、实验所用DNA模板建议先纯化，以避免RNase、蛋白及盐离子残留对反应体系的影响。

3、Transcription Buffer (10×)中含有亚精胺，在低温条件下会使DNA模板沉淀，需在室温条件下配制反应体系。

4、如果需要合成地高辛、生物素等标记的RNA或特殊标记的RNA，请自备相应的修饰NTP。如果需要合成加帽RNA，请自备帽结构或帽类似物。

模板制备

推荐使用以下几种类型的模板，模板可用TE缓冲液或RNase-free Water溶解。

1、质粒模板

带T7启动子的质粒可以作为转录模板，质粒的线性化程度和纯度会影响转录的产量及RNA的完整性。环状质粒由于没有有效的终止，会转录出不同长度的RNA产物，为了得到特定长度的RNA，质粒必须完全线性化，线性化的质粒请确保双链为平末端或5’端为突出结构。

注：

a、RNase、盐离子、蛋白等会对转录反应产生影响，为提高转录实验的稳定性，建议质粒线性化后进行纯化，再作为模板使用。

b、为确保转录产物长度与预期一致，建议质粒酶切后切胶回收目的片段，以获得高纯度长度单一的线性化模板。

2、PCR产物模板

带T7启动子的PCR产物可以作为体外转录模板。PCR扩增模板时将T7启动子（TAATACGACTCACTATAGGG）加在非编码区的上游引物的5’端。PCR产物可直接作为模板，无需纯化，但纯化后可以获得更高产量的RNA。

注：

a、扩增完需要通过琼脂糖凝胶电泳确定产物的特异性和产量。

b、为了获得更多的RNA，建议对PCR产物纯化后作为模板。若电泳条带单一，可以使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物后作为模板。若条带不单一，建议对目的条带切胶回收，回收产物作为模板。

3、合成的DNA模板

合成的带有T7启动子的DNA片段也可以作为体外转录的模板。

实验流程

转录方案

图一 RNA转录方案

体外转录

1、试剂解冻：将Transcription Buffer (10×)室温下解冻和放置。将试剂盒其他组分振荡混匀，短暂离心收集于管底，冰上储存备用。

2、按下表比例配制反应体系。

注：

a、Transcription Buffer (10 ×)中含有亚精胺，在低温条件下会使DNA模板沉淀，因此，需在室温条件下配制反应体系。

b、若果进行多个反应，可以先混匀除模板和RNase Free Water以外的组分，分装到各个管里，再加入模板。

c、反应体系通常为20 μL，可以根据需要按比例放大或缩小体系。

d、对于长模板（>1000 bp），建议使用线性化质粒作为模板。

e、推荐每20 μL体系使用0.1-1 μg模板。

3、混匀、离心、37℃反应2-3 h。

注：

建议使用PCR仪孵育，避免体系蒸发对实验造成影响。

4、(选做）向反应体系中加入1 μL Dnase I (1 U/μL)，37℃孵育15 min，消化DNA模板。

5、合成的RNA经电泳分析后纯化，用RNase-free Water稀释至合适浓度，可用于下游实验。

产物纯化

1、酚/氯仿纯化

a、加入160 μl RNase-free Water将产物稀释至180 μl。

b、加入20 μl 3 M的醋酸钠（pH 5.2）到稀释后的产物中，用移液器充分混匀。

c、加入200 μl的酚/氯仿混合液（1：1）进行抽提，室温10000 rpm离心5 min，将上层溶液（水相）转移至新的RNase-free EP管中。

d、加入与水相等体积的氯仿抽提2次，收集上层水相。

e、加入2倍体积的无水乙醇并混匀，-20℃孵育至少30 min，4℃ 15000 rpm离心15 min。

f、弃上清并加入500 μl预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃ 15000 rpm离心，弃上清。

g、开盖干燥2 min，加入20-50 μl RNase-free Water或其他缓冲液溶解RNA沉淀。

h、-80℃保存。

2、氯化锂纯化

a、20 μL体系中分别加入30 μL RNase Free Water和30 μL Lithium Chloride Precipitation Solution (7.5 M)，使Lithium Chloride的终浓度在2.5-2.8 mM之间。

b、-20℃放置至少30 min（可以放置过夜）。

c、12000 rpm离心15 min，去上清，收集沉淀。

d、用预冷的70%乙醇洗2次，每洗一次，离心5 min，倒弃液体，收集沉淀。

e、晾干RNA，RNase-free Water溶解后检测。

3、柱纯化

柱纯化可以去除蛋白和游离核苷酸。

纯化前加入80 µl RNase Free Water将产物稀释至100 µl，再按柱纯化说明书进行纯化。

4、磁珠纯化

磁珠纯化可以去除蛋白和游离核苷酸。

按磁珠纯化说明书进行纯化。

RNA分析与定量

1、凝胶电泳分析：转录产物可以使用变性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析，评估产物的长度、完整性以及产量。

2、紫外吸收法进行RNA定量：游离核苷酸会影响定量的准确性，采用此方法前请先进行RNA纯化。

3、染料法进行RNA定量：用RiboGreen染料进行RNA定量，游离核苷酸不会影响定量，可以对纯化或者未纯化的反应产物中的RNA进行准确定量。

常见问题及解决方案

1、转录产物产量低

①实验组模板中含有抑制反应的成分

建议：重新对模板进行纯化，确定模板量及其完整性。

②实验模板序列本身原因

建议：加大模板投入量；延长反应时间；换用其他启动子和RNA聚合酶进行转录。

2、短片段转录产量低

转录产物小于0.3 kb时，可以通过延长反应时间（4 h-过夜反应）或增加模板量来提高RNA产量。

3、RNA产物片段与预期不符

（1）RNA产物片段小于预期

①模板序列中包含类似于T7 RNA聚合酶的终止序列。

建议：尝试不同的RNA聚合酶。

②模板中GC含量高形成高级结构。

建议：可以加入SSB蛋白，以提高转录效率，或者使用42℃进行转录会提高转录产物的产量。

③RNase污染。

建议：实验过程中戴口罩、戴一次性手套并注意更换手套。使用一次性无酶枪头、EP管。实验试剂使用前离心，避免试剂在瓶盖或管口导致污染，开盖要小心，避免污染。

（2）RNA产物片段大于预期

①若是以线性化质粒为模板，可能质粒模板没有完全线性化，或者有义链3'端为突出结构。质粒作为模板必须完全线性化，即使存在小量的未线性化模板，也可能产生大量的长片段RNA产物。

建议：重新线性化质粒，要确保线性化完全，并检查模板结构，确保有义链3'端不能是突出结构。

②RNA存在未完全变性的二级结构。

建议：使用变性胶来检测RNA产物。

4、产物电泳拖尾现象

①转录及纯化过程被RNase污染

建议：使用RNase-free的枪头和EP管，实验中所用试剂都为RNase-free，戴一次性乳胶手套。

②电泳过程中被RNase污染

建议：电泳缓冲液用RNase-free Water配制，电泳槽和制胶器具用RNase-free Water浸泡，缩短电泳时间。

③DNA模板被RNase污染。

建议：重新纯化模板DNA。

仅供科研实验使用