027-87877773
产品说明：
生物素3'末端DNA标记试剂盒(Biotin 3' End DNA Labeling Kit)能够利用终端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase，TdT)将生物素标记的脱氧尿嘧啶三磷酸(dUTP)添加到DNA分子的3'末端。这种标记的优点是：不干扰杂交反应，不影响EMSA检测。该试剂盒标记的生物素化DNA探针适用于常见的核酸实验，包括Northern印迹、Southern印迹、EMSA凝胶迁移位移（也称为gel shift）、菌落杂交或原位杂交等。
终端脱氧核苷酸转移酶(TdT)能够在不依赖模板的情况下催化DNA分子3'末端与脱氧核苷三磷酸(dNTP)之间的连接反应。在TdT催化下，单链DNA分子3'末端与dNTP反应效率最高，其次依次是：3'端末端凸出的双链DNA分子，平端DNA分子。所以，我们尽可能让DNA处于单链的情况下进行标记，特别是对于EMSA实验，可先单链标记再进行退火步骤。
参照实验标准步骤标记，每次标记反应的DNA探针量约为5pmol。
本试剂盒特点：
1. 标记速度快，30分钟内完成标记；
2. 避免了使用同位素的危害和污染物的处理；
3. 标记产物稳定，可以长期存放一年;
4. 本试剂盒标记产物适合于多种分子生物学实验，干扰小。
试剂盒组分：
组分名称 | 组分说明 | |
12T | 25T | |
TdT Buffer(5X) | 150ul | 300ul |
TdT(10U/μl) | 15ul | 30ul |
Biotin-11-dUTP(5μM) | 65ul | 130ul |
标记终止液 | 200ul | 200ul |
TE | 1ml | 1ml |
ddH2O | 1ml | 1ml |
说明书 | 1份 | |
保存条件：
-20℃保存。
其他需要准备的材料：
• 超纯水；
• 待标记DNA（1µM）；
• PCR仪器，水浴锅或可设置37℃的金属浴；
• 氯仿/异戊醇Chloroform: isoamyl alcohol (24:1)；
• 吸头和离心管
操作说明：
1. 准备工作：
将试剂盒中的各个组分恢复至室温（TdT酶务必放在-20℃，使用时放在冰盒上）；
待标记的DNA片段调整至1μM；如果DNA为双链，请先变性为单链，标记效果会更好。
2. DNA探针的标记：
以下示例为每次标记5pmol DNA 3'-OH 末端最优配制。Mg2+、蛋白质和残留琼脂糖的存在可能会降低标记效率。 在以下反应中仅使用纯化的 DNA。再次强调： 对于双链 DNA 的标记，需要先将其变性后，标记效果会更好，使用之前将其退火复性。
2.1 按照以下体系配置反应体系
50ul反应体系设置如下：
ddH2O | 29μl |
TdT Buffer (5X) | 10μl |
待标记DNA探针(1μM) | 5μl |
Biotin-11-dUTP (5μM) | 5μl |
TdT (10U/μl) | 1μl |
总体积 | 50μl |
2.2 配制好以后轻轻混匀反应体系，PCR仪或者水浴锅上37℃反应30分钟。
2.3 加入2.5μl标记终止液，轻轻混匀终止反应。
2.4 加入52.5μl氯仿-异戊醇(24:1)，振荡混匀；12,000-g离心3分钟。吸取上清即为被生物素标记的DNA探针。
3. 探针的纯化(可做步骤)：
标记好的探针可以直接用于实验，但是为了追求更好是实验效果，可以按如下步骤进行纯化：
3.1 50ul标记好的探针，加入1/4体积（即12.5μl）的5M醋酸铵，再加入2体积（100μl）的冰冻无水乙醇，轻轻混匀；
3.2 -20℃沉淀过夜；
3.3 4℃，12,000g离心30分钟；离心完毕后，小心去除上清，保留沉淀，微晾干沉淀；
3.4 加入25μl TE，待其完全溶解沉淀；标记好的探针可以放在-20℃保存。
鄂公网安备：
