Anti-c-Myc Affinity Beads

1.产品介绍

Anti-c-Myc Affinity Beads可以检测原核、真核表达的c-Myc标签融合蛋白。c-Myc 多肽是由人类染色体8q24.上的c-Myc基因编码，对应于人类P62的410-419 (EQKLISEEDL) 氨基酸。Anti=c-Myc Affinity Beads可以识别C端，N端或内部c-Myc标签蛋白融合蛋白,可应用在Western-blot 杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中，用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。

表1. Anti-c-Myc Affinity Beads产品性能

2.试剂准备

2.1样品准备

上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用平衡液对样品或细胞培养液稀释,或者用平衡液透析。样品在上样前建议离心或用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤,减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2.2缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤。

平衡/洗杂液: 50 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH7.4

酸性洗脱液: 0.1 M glycine HCI, pH3.0

竞争性洗脱液: 50 mM Tris, 0.15 M NaCl, 100-500 μg c-Myc多肽/ml, pH7.4

中和液: 1 M Tris-HCl, pH8.0

3.样品纯化

3.1柱层析

1)将Anti-c-Myc Affinity Beads装入合适的层析柱，用5倍柱体积的平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下。

2)将样品加到平衡好的Anti- c-Myc Affinity Beads中,收集流出液，可以反复上样增加结合效率。

3)用10-50倍柱体积的洗杂液进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4) A酸性洗脱:使用5倍柱体积的酸性洗脱液洗脱，收集管中预先加好中和液，加入量10-20 μl中和液/ml洗脱液，分管收集。注:酸性洗脱后填料要立即用平衡液平衡, Anti- c-Myc Affinity Beads在洗脱液中不要超过20 min。

B竞争性洗脱:使用5倍柱体积的竞争性洗脱液洗脱。分管收集。

5)使用3倍柱体积的洗脱液再生，然后用平衡液平衡至中性。

6)然后保存在含0.02%叠氮化钠的PBS溶液中，2-8"C保存。

3.2静态吸附

1)填料准备:取适量的Anti- c-Myc Affinity Beads加入层析柱中，流干保护液。加入5倍柱体积的平衡液清洗。

2)加入样品溶液，4C或室温震荡孵育至少30 min(不能磁力搅拌)，确保填料与样品溶液充分混合。

3)孵育完毕后，将填料混合液离心(5000xg 离心1 min)或过滤收集填料。

4)将填料装入层析柱中，用平衡液清洗直至紫外稳定。

5)用酸性洗脱液或竞争性洗脱液洗脱，参考3.1中4)。

6)填料再生和保存参考3.1中5)和6)。

3.3免疫沉淀操作流程

1)填料准备:取40μl的Anti-c-Myc Affinity Beads (柱体积20 ul)混合液加入到1.5 ml离心管中, 5000xg 离心1 min,吸弃上清。

2)填料平衡:加入0.5 ml平衡液,悬浮填料(使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用)，5000xg 离心1 min,吸弃上清。重复一次。

3)样品结合:加入200-1000 μl样品裂解液或细胞抽提物到处理好的填料中，混合均匀,在室温下置于混合仪轻轻翻转离心管,促使样品和填料充分接触并吸附，室温至少1 h。5000xg 离心1 min,吸弃上清。

4)洗杂:加入0.5 ml的洗杂液，悬浮填料，轻轻混匀，5000xg 离心1 min,吸弃上清。再重复三次。确保去除非特异性吸附。

5)样品洗脱:可根据后期检测的需要选择不同的洗脱方法。

A:酸性洗脱

加入100 ul酸性洗脱液，悬浮填料。室温孵育5 min, 5000xg 离心1 min。小心取出上清，不要吸到填料，用中和液中和。洗脱样品放置4℃，长时间放置20"C保存。

B:竞争性洗脱

加入100 μl竞争性洗脱液洗脱。室温孵育30 min, 5000xg离心1 min。小心取出上清,不要吸到填料。洗脱样品放置4C,长时间放置-20°C保存。

C:变性洗脱

实验室常规蛋白上样缓冲液(Loading Buffer)中含有巯基乙醇和DTT,可以使填料中抗体重链和轻链断开。含有SDS的样品缓冲液可以使Anti-c-Myc抗体变性,洗脱后的Antic Myc Affinity Beads没办法重复使用。每管中加入20 ul 2x Loading Buffer, 95"C 加热5 min。5000xg 离心1 min,吸取上清SDS PAGE电泳检测。

4.问题及解决方案

*本试剂仅供实验室研究使用