PreScission Protease产品说明书

保存条件：-20℃，一年有效。

1.产品简介：

PreScission Protease是一种由人鼻病毒14型的3C蛋白酶（human rhinovirus (HRV) type 14 3C protease）和GST组成的融合蛋白。该蛋白酶可在低温下（4°C）特异识别短肽Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，并在Gln和Gly氨基酸残基之间进行酶切。底物的识别和切割不仅依赖于融合蛋白的一级结构还依赖于融合蛋白的二级和三级结构。它可以特异性的将pGEX-6P系列等载体表达出的带有酶底物识别多肽序列融合蛋白的GST标签进行分离。本品由大肠杆菌中重组表达，以无菌液体形式提供。

2.产品来源：

大肠杆菌表达

3.纯度：

经SDS-PAGE及HPLC分析，纯度> 95%

4.缓冲液组分：

50 mM Tris，pH 8.0，0.5 mM EDTA，1 mM DTT

5.比活性：

1U/ul

6.酶活定义：

在5℃条件下反应16小时，能够切割10µg的GST标签的融合蛋白达90%以上所需的酶量定义为一个活性单位

7.使用方法：

工作液浓度应根据具体实验确定，建议进行预实验摸索最佳实验浓度。

1）初始条件摸索a. 按照下表设置酶切反应体系：

b. 将反应混合物置于4℃反应15-16h；

c. 取20μL样品进行SDS-PAGE电泳分析，根据结果，优化反应所需的最适酶量，重复步骤；

d. 在实际操作中，建议酶用量1:25-1:100U/μg融合蛋白。

2）柱上酶切GST标签蛋白（以10mg GST标签蛋白/mL凝胶为例）

a. 4℃条件下，使用10倍柱体积酶切缓冲液洗涤已结合GST标签蛋白的纯化柱，并去除残留缓冲液；

b. 准备PreScission Protease：约每100μg GST标签蛋白使用2U PreScission Protease (或按照经步骤1优化后的条件)。对于10mg GST标签蛋白需使用200U PreScission Protease，用PreScission酶切缓冲液稀释至与凝胶柱相同的体积，即1mL。

c. 将稀释好的1mL PreScission Protease泵入纯化柱中，4°C保持4-8h（为确保酶切完全，可以4°C酶切过夜）。如果蛋白结合是在离心管中进行的，可将准备好的PreScission Protease直接加入离心管中，4°C在摇床上缓慢摇动4-8小时（为确保酶切完全，可以4°C酶切过夜）。

d. 用1倍柱床体积的PreScission Protease酶切缓冲液洗涤，重复三次，分别收集每次的洗涤液。如果酶切反应是在离心管中进行的，1000g离心2分钟，收集上清，然后加入1mL酶切缓冲液重悬沉淀，离心(1000g×2min)收集上清，接着再加入1mL酶切缓冲液重悬沉淀，离心(1000g×2min)收集上清。洗脱组分中含有切除了GST标签的目的蛋白，而GST标签和带有GST标签的PreScission Protease则仍然结合在凝胶柱上。

3）柱下酶切GST标签蛋白（以10mg GST标签蛋白/mL凝胶为例）

a. 使用脱盐柱快速除去洗脱组分中的GSH、咪唑等特殊组分，或用PreScission Protease酶切缓冲液进行透析。

b. 按每100μg标签蛋白加入2U PreScission Protease的比例加入蛋白酶，4°C孵育4-8h或者过夜。

c. 将酶切后的蛋白样品加入预先用PreScission Protease酶切缓冲液平衡好的GST纯化柱，室温结合20-30分钟。

d. 500g离心5分钟，收集上清，其中含有切除了标签的目的蛋白，PreScission Protease则结合在凝胶沉淀中。如果目的蛋白是GST标签蛋白，那么残留的没有被酶切的GST标签蛋白、PreScission Protease和酶切下来的GST标签则结合在凝胶沉淀中，切除了标签的目的蛋白在溶液中。

*本试剂仅供实验室研究使用