产品介绍：

2019年底，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）开始肆虐全球，对全人类生命健康造成巨大威胁。该病毒通过刺突蛋白（Spike protein,S）受体结合域（Receptor Binding Domain,RBD）识别细胞表面受体-血管紧张素转化酶 2（Angiotensin I Converting Enzyme 2,ACE2）并与其结合，在相关蛋白协助和介导下侵染细胞。

本试剂盒可检测的中和抗体为针对S蛋白并且可以阻断其与ACE2结合的抗体；本试剂盒可以检测任何物种体液中针对S蛋白的中和抗体。

本试剂盒预包被酶标板上通过共价固定S蛋白RBD片段，其可以与HRP-ACE2偶联物特异性结合，然后通过TMB在HRP-ACE2偶联物的HRP酶催化下显色；如果待检测样本或者标准品中含有针对S蛋白中和抗体会阻断HRP-ACE2偶联物与固定的RBD片段的结合，因此中和抗体含量与TMB显色值呈负相关。

本试剂盒可检测血清、血浆或其他体液中针对S蛋白的中和抗体，不受待检样品种属和抗体亚型的限制。

虽然本试剂盒中标准品为标准浓度，但是由于不同中和抗体亲和力不同，所以参照本试剂盒标准品测算的中和抗体浓度为相对浓度，因此称为半定量。

试剂盒组成：

储存方法：

请按各个组分对应的温度存储，该试剂盒在各组分未拆封的情况下，自生产之日起可存放6个月以上。

试剂准备:

1.从冰箱中取出所有试剂，在使用前平衡至室温（20℃至 25℃）。 未用完后的所有试剂保存在冰箱中。

2.使用前应将所有样品和对照品进行离心。

3.HRP-ACE2工作液：将HRP-ACE2偶联复合物（100×）用  通用稀释液按 1：100进行稀释，即为HRP-ACE2工作液；

4.洗涤液：将 浓缩洗涤液（25×）用 ddH₂O 以体积比 1:24 进行稀释（稀释25倍），即为洗涤液。

注意：如浓缩洗涤液（25×）中有沉淀，请在水浴（最高 50℃）中温育、混合至沉淀溶解。

中和抗体标准品、阴性对照品和待检样品的准备

1.   将中和抗体标准品用 通用稀释液 做连续2倍倍比稀释，稀释后中和抗体标准品浓度依次为10ug/ml, 5ug/ml, 2.5ug/ml, 1.25ug/ml, 0.625ug/ml, 0.313ug/ml, 0.156ug/ml,

2.   阴性对照品用 通用稀释液 以体积比 1:9 进行稀释，即稀释10倍。

例如，50μL 样品加入450μL 通用稀释液。

3.   将待检样品用通用稀释液以体积比 1:9 进行稀释，即稀释10倍。

例如，10μL 测试样品加入90μL 通用稀释液。 

预包被酶标板准备及加样顺序安排

1. 设置标准品孔、阴性对照品孔和待检样品孔，最好做两个平行重复孔，有条件的可以做三孔平行重复。

2.根据标准品孔、阴性对照品孔和待检样品孔的数量抠取所需酶标板孔条（有条件的可以考虑样品做三次平行重复）。 确保板孔条牢固地卡入板框，未使用的板孔条及时装入有干燥剂铝箔袋密封-20℃保存。

检测操作步骤

1、 将稀释好的中和抗体标准品、阴性对照和待检测样品，依次加入酶标板孔，每孔50ul；

加入标准品孔的标准品浓度依次为：10ug/ml, 5ug/ml, 2.5ug/ml, 1.25ug/ml, 0.625ug/ml, 0.313ug/ml, 0.156ug/ml, 阴性对照品

2.以上每孔中再立即加入HRP-ACE2工作液，每孔50ul,加完后震荡仪轻轻混匀；

3.用酶标板膜覆封盖板孔，在 37℃ 下孵育 60 分钟；

4.取下平板密封膜，用 350μL 的 洗涤液 洗涤酶标板孔 3 次；

5.洗涤完毕后在吸水纸上拍干孔内液体；

6.每孔立即加入100uL TMB底物液，室温显色10-15分钟，待其显色稳定后立即在每孔加入50uL底物反应终止液

吸光值读取：

提前10分钟打开酶标仪，待其预热稳定后方可使用。

将显色反应终止的酶标板放入酶标仪，设定好检测波长450nm(最好设置双波长：以450nm为吸光波长， 630nm为参考波长)；

TMB底物反应时间与温度有关，比较适宜温度为25℃左右；温度太低，反应速度慢，温度高，背景较深，边缘效应严重。

待测样品中和抗体浓度计算：

通过标准品浓度及其对应OD值建立标准品曲线，将待检样品OD值代入拟合曲线公式计算待检样品中中和抗体浓度。

1.  可以使用Curve Expert绘制标准曲线，并且通过其拟合曲线公式进行样品浓度计算；

2.  当检测样品OD值或者标准品OD值高于阴性对照品OD值时，应该予以舍弃，不予纳入计算，此可能为样品个体差异所引起的干扰。试剂盒所使用的通用稀释液为标准稀释液，与复杂的体液环境还是有一定差异，所以只有OD值低于阴性对照品的OD值才纳入计算范围。

典型数据：

*本试剂仅供实验室研究使用