荧光-小动物活体成像领域的应用

小动物活体成像领域的应用

活体动物体内成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。小动物活体成像是近年来在生物医药方面非常活跃和前沿的领域，在研究细胞行为，药物活性和代谢，疾病的进展等方向取得了革命性的进步。分为生物发光成像（以Caliper和Xengon仪器为代表）和荧光成像（以KODAK和CRI仪器为代表）。

1. 荧光成像的推荐步骤：

1）SPF级 BALB/C裸鼠，6～8 周龄，18～20克，实验前24 h 自由进食、饮水。

2）于实验裸鼠腹腔内注射2%戊巴比妥钠300μL(215 mg/ kg)麻醉动物。将裸鼠俯卧位平放于小动物多光谱活体成像系统的记录暗箱中。实验时将Cy7或Cy7标记的生物分子或药物最好溶于水（或甲醇/乙醇/乙二醇，有时DMSO 200uL能把小鼠杀死）稀释后，于裸鼠尾静脉注射200μL（浓度0.5 mg/mL）[最佳用量和时间需要客户根据自己的仪器和药物试剂等条件优化]。每5min 记录1 张动物在体内发射荧光的成像图片，分析荧光药物的分布情况。

对照鼠不注射药物，进行同时记录。记录结束后迅速解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器，进行成像。

3）Cy7 检测时激发波长700～770 nm带通，发射波长790 nm长通。液晶可调谐滤光片扫描范围 780～950 nm，扫描步进10 nm。曝光时间为500 ms。

    不同的药物代谢时间不一样，注射入裸鼠体内，荧光立即分布全身，然后逐步向膀胱聚集，呈现显著的肾排泄的特点一般4～6小时，快的只有30分钟；如果是骨骼和鼻腔等部位靶点的Cy7标记药物，有客户反映一周后活体成像系统仍能检测到荧光成像。

器官切片观察：将解剖的器官迅速放置于4%多聚甲醛固定4小时以上，0%，20%，30%PBS蔗糖依次沉底，20μm切片，多聚赖氨酸洗过的载玻片贴片，晾干，DAPI染色。共聚焦显微镜观察，激光器为氦氖 633 nm。

2. 荧光成像常见问题

1）什么类型的小鼠适合活体成像？

   毛发对光有散射，建议用裸鼠。

2）给裸鼠注射的最佳和最大注射试剂体积？

   试剂的体积用量根据所采取的方式不同而不同，下面是体重25g的裸鼠注射量。

3）注射针头的尺寸是多少？

   推荐使用具有固定针头的28～32号结核菌素或胰岛素注射器（0.3或1mL）

4）肿瘤成像需要注射多大剂量的标记抗体？

   推荐起始用量50µg来优化最佳用量。

5）未标记的染料在老鼠体内如何代谢？

   未标记水溶性染料通过膀胱排泄，静脉注射后最快能在3min检测到膀胱内的荧光信号。

6）注射后多长时间开始成像？

成像时间和成像持续时间与注射试剂有关。血管示踪剂注射后马上即可成像并持续成像数小时。注射标记的抗体IgG 到达靶点需要数小时，而后才成像并持续成像数天。

7）Super Fluor dyes的荧光寿命是多少？

Super Fluor 647在20°C水中τ＝1 ns

Super Fluor 680在20°C水中τ＝1.2 ns

Super Fluor 750在20°C水中τ＝0.7 ns

8）推荐小动物活体成像的网站。http://radiologycme.stanford.edu