[Frdbio标记技术要点]-抗体标记成功的关键

[Frdbio标记技术]-抗体标记成功的关键

对抗体进行修饰标记的，是我们免疫检测中必行之径；

经常有实验者询问：为啥抗体标记不成功或者标记效率低，

在排除你所使用的试剂或者试剂盒的问题之外，我们首先必须处理好自己的样品-抗体

1） 抗体的浓度和纯度必须准确，对于蛋白抗体浓度的测试，市面上有商业的试剂盒，比如BCA，Bradford 方法，用不同方法测试的浓度值，往往相差甚远，可能更多的受到溶液成分的干扰； Frdbio独自钟爱SDS-PAGE法，这个方法的操作就是通过标准浓度BSA浓度与样品在同块PAGE上平行电泳，通过染色脱色平行做浓度比对得出结果，我们认为这个结果更可靠一点，这个是真正“看得见摸得着的”。

2） 抗体溶液的离子环境问题，我们首要关注的是游离的铵离子问题，我们抗体溶液中的游离铵离子浓度经常超标，而这些超标的铵离子浓度是标记的致命影响因素，因为90%以上的标记试剂盒标记的抗体活性基团是-NH2. 在我们纯化的过程中，我们一般会用到甘氨酸洗脱， 1.0M Tris-Cl中和，这里面含有大量的游离氨，会喧宾夺主，优先与其反应。

如果我们用到0.1-0.15M 甘氨酸洗脱，然后等体积1.0M Tris-Cl中和的话，我们样品里面游离氨基含量为0.55M，通常1mg/ml抗体的浓度为6.67uM,通常我们透析不一定能够完全把这个Tris和甘氨酸去掉，取决于透析液体积，透析离子交换时间，透析次数；而往往标准的SOP仅仅告诉“透析3次，每次2小时”，其实这个不严谨的步骤；那么我们如果用超滤法去除游离胺离子，0.5ml的离心管，12000rpm 5分钟，每次可以置换掉400ul,按照这个置换量计算，理想状态下至少要置换6次才能将Tris和甘氨酸浓度将为抗体浓度的1%

能标记抗体的试剂盒一般也可以标记蛋白，蛋白制备的方法纷繁复杂，其中可能引入更多含有游离氨基的物质，比如尿素等。所有不管我们标记什么我们都必须处理好自己样品问题。