关键词:抗体制备抗体标记重组蛋白表达

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[Frdbio标记技术要点]-抗体标记成功的关键

来源:Frdbio发布时间: 2021-03-22 11:24:20丨 650人浏览

[Frdbio标记技术]-抗体标记成功的关键

对抗体进行修饰标记的,是我们免疫检测中必行之径;

经常有实验者询问:为啥抗体标记不成功或者标记效率低,

在排除你所使用的试剂或者试剂盒的问题之外,我们首先必须处理好自己的样品-抗体

 

1) 抗体的浓度和纯度必须准确,对于蛋白抗体浓度的测试,市面上有商业的试剂盒,比如BCA,Bradford 方法,用不同方法测试的浓度值,往往相差甚远,可能更多的受到溶液成分的干扰; Frdbio独自钟爱SDS-PAGE法,这个方法的操作就是通过标准浓度BSA浓度与样品在同块PAGE上平行电泳,通过染色脱色平行做浓度比对得出结果,我们认为这个结果更可靠一点,这个是真正“看得见摸得着的”。

2) 抗体溶液的离子环境问题,我们首要关注的是游离的铵离子问题,我们抗体溶液中的游离铵离子浓度经常超标,而这些超标的铵离子浓度是标记的致命影响因素,因为90%以上的标记试剂盒标记的抗体活性基团是-NH2. 在我们纯化的过程中,我们一般会用到甘氨酸洗脱, 1.0M Tris-Cl中和,这里面含有大量的游离氨,会喧宾夺主,优先与其反应。

如果我们用到0.1-0.15M 甘氨酸洗脱,然后等体积1.0M Tris-Cl中和的话,我们样品里面游离氨基含量为0.55M,通常1mg/ml抗体的浓度为6.67uM,通常我们透析不一定能够完全把这个Tris和甘氨酸去掉,取决于透析液体积,透析离子交换时间,透析次数;而往往标准的SOP仅仅告诉“透析3次,每次2小时”,其实这个不严谨的步骤;那么我们如果用超滤法去除游离胺离子,0.5ml的离心管,12000rpm 5分钟,每次可以置换掉400ul,按照这个置换量计算,理想状态下至少要置换6次才能将Tris和甘氨酸浓度将为抗体浓度的1%


能标记抗体的试剂盒一般也可以标记蛋白,蛋白制备的方法纷繁复杂,其中可能引入更多含有游离氨基的物质,比如尿素等。所有不管我们标记什么我们都必须处理好自己样品问题。



 



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