关键词:抗体制备抗体标记重组蛋白表达

027-87877773
首页 > 技术资料 > 分子与细胞实验

密码子优化(Codon optimization)并非易事,高效利用密码子优化工具及网站

来源:frdbio发布时间: 2020-07-30 10:41:49丨 4291人浏览

  从事重组蛋白表达的实验人员对密码子优化问题并不陌生,所涉及到的原理是:不同的物种编码某氨基酸所使用的密码子偏好性不同,因为不同物种内氨基酸对应的tRNA丰度不同;连续两个以上的稀有密码子在一起,很可能造成翻译效率急剧下降、暂停甚至翻译终止。基于此原理,如果我们在进行密码子优化的时候仅仅粗暴地把密码子同义替换为该物种使用频率最高那个密码子,往往起不到最佳效果,有可能还适得其反;主要是因为,密码子优化本身没那么简答。

   进行密码子优化的本意是消除稀有密码子,这里所谓的稀有密码子概念是针对某个具体的物种而言,大肠杆菌的某个稀有的密码子对于哺乳动物来说可能是友好的密码子。在替换稀有密码子的时候还必须考虑调整GC含量、酶切位点和mRNA的稳定性等,即使考虑到以上要点,但是对于很多异源性仍然表达量很低,有的甚至比未优化之前效率更低,那是因为我们还忽略了翻译动力学、翻译后折叠和代谢水平等因素,蛋白质表达是一个系统工程,需要整体考虑,密码子优化并非易事。

  除了我们耳熟能详的制约密码子优化的成败的因素外,随着研究的不断进展,文献还报道了密码子协调性和密码子敏感性也制约着密码子优化对重组蛋白表达及其品质的提升,除此以外还有很多的未知因素。

密码子协调性是要求我们在密码子优化的时候着力于:1)用宿主中最相似频率的同义密码子替换原序列密码子;2)根据宿主密码子频率随机同义替换原基因密码子。蛋白质在机体内表达速率决定了它的活性,在源物种内选用什么频率的密码子是长期自然选择的结果,任何改变密码子频率可能影响其翻译速度,这样往往造成不正确的折叠,目前已经有很多文献报道支持此结论。在传统的策略中为了得到更多可溶性表达蛋白或者活性蛋白,我们会想办法降低其表达速度,原核表达常用的办法有:1)低温诱导:低温诱导降低其生长速度,自然其代谢和蛋白翻译降速,有时间让其正确折叠;

至于密码子的敏感性是指tRNA对其相应转运氨基酸的结合能力,结合能力越强敏感性越高,反之则反;敏感性较高的密码子对于培养液中的氨基酸浓度变化反应较大,所需氨基酸浓度变换严重影响其表达量,缓冲能力较差,这个时候换一个灵敏度较弱的密码子可以有效期到缓冲左右,明显提高产量,这些理论不是笔者胡诌乱扯,是有文献支持的,有兴趣的可以查阅文献。

小结一下:做密码子优化需要注意:1)GC含量调整;2)避免碱基重复;3)避开某些限制酶识别位点;4)Chi-site延伸重组热点;5)SD核糖体结合位点序列;6)CpG含量(真核中影响转录启动);7)TATA box(真核中影响转录启动);8)mRNA二级结构;9)串联稀有密码子;10)密码子重复;11)起始密码子的环境;12)核糖核酸酶E影响mRNA结构稳定性;13)真核表达中的PolyA结构可能干扰提前终止;14)其他未知的可能影响转录和翻译的影响因素。

网络上关于密码子优化软件和在线工具比较多,其算法各有千秋,究竟该如何抉择呢?生物实验没有一招鲜,所以实践是检验真理唯一标准,网络工具仅供参考;所谓兼听则明,可以同时用几个密码子优化工具,同时做对比测试,当然这样成本会比较高,就是看您是选择成本优先还是时间优先原则了。

我们之前有一篇利用商业公司网站进行密码子优化的(http://www.friendbio.com/meansMore/id/69),步骤有点繁琐为了大家科研工作方便,我们将一款比较简单的密码子优化工具jcat翻译成中文供大家使用。

地址链接是:www.friendbio.com/codon.html

重组蛋白问题找小福,小福只讲通俗易懂的实验技能

我们专注于重组蛋白表达与抗体制备,垂询技术组QQ657047932


此文网络刊载之后,很多人联系我们咨询,如果大肠杆菌重组表达在进行密码子优化的时候该选择哪一个,因为我们目前所有的大肠杆菌工程菌基本都是来源于E.coli K12,所以如下图选择就可以了。有问题可以继续问小福

 


  • 您是否还在苦恼?


  • 抗原选多肽还是重组蛋白?

  • 多肽表位设计?

  • 重组表达密码子优化?

  • 免费咨询frdbio技术专家

提交成功

您的提交已成功
感谢您关注Frdbio
如果您的问题比较紧急
请拨打我们的技术支持电话:

18627067678
657047932

福因德科技(武汉)有限公司©2008-2020 网站备案号:鄂ICP备17002573号-1   鄂公网安备: 42018502001815号