考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量

【实验原理】

考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465 nm，后者在595 nm。在一定蛋白质浓度范围内（1~1000 mg），蛋白质与色素结合物在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

【仪器、材料与试剂】

（一）仪器

 1. 分光光度计

2. 台式离心机

（二）材料

1. 叶片或根系

2. 磷酸氢二钠

3. 磷酸二氢钠

4. 考马斯亮蓝G-250

5. 95％乙醇

6. 85%磷酸

（三）试剂

1.  0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na₂HPO₄·12H₂O（分子量358.14）71.7g；

B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH₂PO₄·2H₂O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na₂HPO₄) 228.75ml，B母液(NaH₂PO₄) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

2.  考马斯亮蓝溶液：称取100 mg 考马斯亮蓝，溶于50 ml 95％乙醇中，加入100 ml 85％（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L。在黑暗中静置2小时后用漏斗过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。

【实验步骤】

1. 酶液提取 

称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为蛋白粗提液。

2. 酶活性测定

取100ml酶液，加入2.9ml考马斯亮蓝溶液，反应2min后测OD₅₉₅。

3. 计算结果

蛋白质含量（mg/g）=（查得的蛋白质含量/ug×提取液总体积/ml）/（样品鲜重/g×测定时所用提取液体积/ml）

Protein content(mg/g)=(C/ug×VT/ml)/(W/g×Vs/ml×1000)

C为可溶性蛋白质含量（mg/g ），VT为提取液总体积（ml）；Vs为测定时所用提取液体积（ml）；W为样品鲜重（g）。

【注意事项】

还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有影响。