抗体的纯化——抗原配体特异性纯化

1. 抗原(抗体/蛋白)特异性亲和柱制备

1.1 含氨基配体特异性亲和柱的制备

1.1.1 称取0.3 g溴化氰活化的琼脂糖凝胶（CNBr-activated Sepharose 4B）干粉加入1mM盐酸中，常温搅拌至少30min或者4℃过夜使其充分溶涨，0.3g可以获得1ml溶涨胶。也可直接取1ml NHS活化的琼脂糖凝胶。

1..12 将凝胶转移入纯化柱中，用约30ml 1mM的HCl抽滤介质3次。抽滤去除内部空气气泡。

1.1.3 用5～10倍体积的超纯水清洗介质一遍，（留1～2倍体积超纯水将凝胶重悬起来）。

1.1.4 将含氨基待偶联抗原/蛋白用偶联缓冲液（0.5M NaCl，0.1M NaHCO3，pH8.3）溶解成2mg/ml浓度。

1.1.5 将重悬的凝胶与待偶联抗原/蛋白-偶联缓冲液迅速混合，室温（25℃）反应2h以上，期间不断摇动，使其充分偶联反应；

1.1.6 偶联结束，取上清液检测是否还有游离未偶联的配体（蛋白或抗体），检测方法：用分光光度计直接检测计算，如果溶液中配体含量＞0.2mg/mL，说明偶联饱和；否则重复第1.1.4～第1.1.5）步。一般1ml凝胶可以偶联10mg抗体/蛋白配体。

1.1.7 确认偶联完全后，取 15ml封闭缓冲液（1M 乙醇胺,0.5M NaCl,pH8.3或0.1M Tris-Cl,pH8.5）室温(25℃)孵育2h或4 ℃过夜；

1.1.8 交替使用20ml的偶联缓冲液和20ml的乙酸盐缓冲液（0.5M NaCl，0.1M HAc-NaAc，pH4）洗凝胶柱4次;

1.1.9 亲和柱制备好后，用PBS平衡后即可用于抗体纯化；

1.1.10 如若暂不使用，用20%的乙醇（含20% 乙醇，0.02% NaN3的PBS）保存。

1.2 含巯基抗原/多肽特异性亲和柱的制备

1.2.1 取适量Sulfolink Beads去掉保护剂，用3倍柱床体积的偶联缓冲液（50Mm Tris,5mM EDTA-Na,pH8.5）洗涤柱子3次。

1.2.2 将含巯基抗原/多肽用偶联缓冲液溶解成2mg/ml,加入Sulfolink Beads，室温(25℃)摇晃孵育2h。

1.2.3 去除步骤1.2.2中的缓冲液，收集检测；用3倍柱床体积的偶联缓冲液清洗柱床。

1.2.4 加入等体积的封闭液（50mM Tris-HCl,5mM EDTA-Na,50Mm L-半胱氨酸，Ph8.5）, 室温(25℃)孵育2h。

1.2.5 柱子用3倍体积的PBS(pH7.4)洗涤3次，可立即使用；如暂不用，可以保存在20%的乙醇（含20% 乙醇，0.02% NaN3的PBS）中。

2. 抗原(抗体/蛋白)特异性亲和纯化抗体

其纯化步骤与Protein A /Protein G/ Protein L亲和纯化方法相同。