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从单B细胞克隆和表达人单克隆抗体的策略
来源：frdbio丨
发布时间：
2023-12-14 15:23:56丨
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IgH 和 IgL 链基因通过巢式 RT-PCR 从单细胞 cDNA 中扩增，该 cDNA 是通过随机六聚体扩增产生的，然后连接到真核表达载体中。 使用对前导区具有特异性的正向引物混合物和对相应 IgH、Igκ 或 Igλ 恒定区具有特异性的反向引物进行第一次 PCR。 使用对 FWR1 具有特异性的正向引物混合物和对 IgH、Igκ 和 Igλ J 基因或恒定区具有特异性的相应嵌套反向引物进行第二次 PCR。 如果第二个PCR引物含有限制性位点，则对产物进行测序并直接克隆。 或者，为了避免使用引物混合物引入氨基酸交换以及为了克隆全长 Igκ 基因，对第二次 PCR 产物进行测序以确定各自的 V 和 J 基因。 之后，以第一次PCR产物为模板，使用含有限制性位点的V基因和J基因特异性引物进行另一轮扩增。 所有 PCR 产物在表达载体克隆之前和之后均进行测序。 为了生产重组抗体，将含有与原始 PCR 产物具有 100% 同一性的插入片段的质粒共转染至 HEK 293 细胞中，并在培养后从上清液中纯化抗体。
附1.细胞分选标志物表型
| Source | B cell population | Phenotype |
|---|---|---|
| Bone marrow | Early immature | CD19+CD34−CD10+IgM− |
| Immature | CD19+CD34−CD10+IgM+ | |
| Peripheral blood | New emigrant | CD19+CD10+CD27−IgM+ |
| Mature naive | CD19+CD10−CD27−IgM+ | |
| IgM+ memory | CD19+CD10−CD27+IgM+ | |
| IgG+ memory | CD19+CD10−CD27+IgG+ |
附2:相关引物序列：
| Forward Primer | 5′ - 3′ sequence |
|---|---|
| 5′ L-VH 1 | ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG |
| 5′ L-VH 3 | AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG |
| 5′ L-VH 4/6 | CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG |
| 5′ L-VH 5 | CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG |
| 5′ AgeI VH1 | CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAG |
| 5′ AgeI VH1/5 | CTGCAACCGGTGTACATTCCGAGGTGCAGCTGGTGCAG |
| 5′ AgeI VH3 | CTGCAACCGGTGTACATTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAG |
| 5′ AgeI VH3-23 | CTGCAACCGGTGTACATTCTGAGGTGCAGCTGTTGGAG |
| 5′ AgeI VH4 | CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAG |
| 5′ AgeI VH 4-34 | CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTG |
| 5′ AgeI VH 1-18 | CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTTCAGCTGGTGCAG |
| 5′ AgeI VH 1-24 | CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTCCAGCTGGTACAG |
| 5′ AgeI VH3-33 | CTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAG |
| 5′ AgeI VH 3-9 | CTGCAACCGGTGTACATTCTGAAGTGCAGCTGGTGGAG |
| 5′ AgeI VH4-39 | CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAG |
| 5′ AgeI VH 6-1 | CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTACAGCTGCAGCAG |
| 5′ L Vκ 1/2 | ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG |
| 5′ L Vκ 3 | CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG |
| 5′ L Vκ 4 | ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG |
| 5′ Pan Vκ | ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG |
| 5′ AgeI Vκ 1-5 | CTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCCAGATGACCCAGTC |
| 5′ AgeI Vκ 1-9 | TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT |
| 5′ AgeI Vκ 1D-43 | CTGCAACCGGTGTACATTGTGCCATCCGGATGACCCAGTC |
| 5′ AgeI Vκ 2-24 | CTGCAACCGGTGTACATGGGGATATTGTGATGACCCAGAC |
| 5′ AgeI Vκ 2-28 | CTGCAACCGGTGTACATGGGGATATTGTGATGACTCAGTC |
| 5′ AgeI Vκ 2-30 | CTGCAACCGGTGTACATGGGGATGTTGTGATGACTCAGTC |
| 5′ Age Vκ 3-11 | TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC |
| 5′ Age Vκ 3-15 | CTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATAGTGATGACGCAGTC |
| 5′ Age Vκ 3-20 | TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT |
| 5′ Age Vκ 4-1 | CTGCAACCGGTGTACATTCGGACATCGTGATGACCCAGTC |
| 5′ L Vλ 1 | GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG |
| 5′ L Vλ 2 | GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG |
| 5′ L Vλ 3 | GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG |
| 5′ L Vλ 4/5 | GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG |
| 5′ L Vλ 6 | GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG |
| 5′ L Vλ 7 | GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG |
| 5′ L Vλ 8 | GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG |
| 5′ AgeI Vλ 1 | CTGCTACCGGTTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTGACKCAG |
| 5′ AgeI Vλ 2 | CTGCTACCGGTTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTGACTCAG |
| 5′ AgeI Vλ 3 | CTGCTACCGGTTCTGTGACCTCCTATGAGCTGACWCAG |
| 5′ AgeI Vλ 4/5 | CTGCTACCGGTTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTGACTCA |
| 5′ AgeI Vλ 6 | CTGCTACCGGTTCTTGGGCCAATTTTATGCTGACTCAG |
| 5′ AgeI Vλ 7/8 | CTGCTACCGGTTCCAATTCYCAGRCTGTGGTGACYCAG |
| 5′ Ab sense | GCTTCGTTAGAACGCGGCTAC |
| Reverse Primer | 5′ - 3′ sequence |
| 3′ Cγ CH1 | GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC |
| 3′ Cμ CH1 | GGGAATTCTCACAGGAGACGA |
| 3′ IgG (internal) | GTTCGGGGAAGTAGTCCTTGAC |
| 3′ SalI JH 1/2/4/5 | TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG |
| 3′ SalI JH 3 | TGCGAAGTCGACGCTGAAGAGACGGTGACCATTG |
| 3′ SalI JH 6 | TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCGTG |
| 3′ Cκ 543 | GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA |
| 3′ Cκ 494 | GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT |
| 3′ BsiWI Jκ 1/4 | GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC |
| 3′ BsiWI Jκ 2 | GCCACCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTC |
| 3′ BsiWI Jκ 3 | GCCACCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTC |
| 3′ BsiWI Jκ 5 | GCCACCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTC |
| 3′ Cλ | CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG |
| 3′ XhoI Cλ | CTCCTCACTCGAGGGYGGGAACAGAGTG |
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