3 5 2 7 牛碱性成纤维细胞生长因子生物学活性测定法

(细胞增殖法/M T T 比色法）

本法系依据牛碱性成纤维细胞生长因子对小鼠胚胎成纤维细胞(BALB/c 3T3 细胞)的生长具有刺激作用， BALB/c 3T3 细胞的生长状况因牛碱性成纤维细胞生长因子生物学活性的不同而不同，以此检测牛碱性成纤维细胞生长因子的生物学活性。

试剂：（1）R P M I 1640培 养 液： 取 RPMI 1640培养基粉末 1 袋 （规 格 为 1L )，加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素10⁵IU 和 链 霉 素 10⁵IU ，再 加 碳 酸 氢 钠 2. l g ，溶 解 后 ，混匀 ，除菌过滤， 4°C 保存。

(2) 维 持 培 养 液 量 取 新 生 牛 血 清 4m l，加 RPMI 1640培养液至1000ml。

(3) 完 全 培 养 液 量 取 新 生 牛 血 清 100ml, 加 RPMI 1640培养液至1000ml。

(4) PBS 称 取 氯 化 钠 8g、氯 化 钾 0. 2g 、磷酸氢二钠1. 44g 、磷 酸 二 氢 钾 0.24g , 加 水 溶 解 并 稀 释 至 1000ml，经121°C 、 15分钟灭菌。

(5)噻唑蓝（MTT)溶 液： 称 取 M T T 粉 末 0.10g ，加 PBS 20ml使溶解，经 0.22um 滤膜过滤除菌。 4°C 避光保存。

标准品溶液的制备:取牛碱性成纤维细胞生长因子标准品 ，按说明书复溶后，用维持培养液稀释至每lm l含 40IU 。在 9 6 孔细胞培养板中，做 4 倍 系 列 稀 释 ，共 8 个 稀 释 度 ，每个稀释度做2 孔^以上操作在无菌条件下进行。

供试品溶液的制备:将供试品按标示量复溶后，用维持培养液稀释成每lm l约 含 40IU 。在 9 6 孔细胞培养板中，做4 倍系列稀释，共 8 个稀释度，每个稀释度做2 孔 。以上操作在无菌条件下进行。

测 定 法 :BALB/c 3T3 细胞株用完全培养液于37°C 、 5 %二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每lm l含1.0*10^5〜5.0* 10⁵ 个 细 胞 ，传 代 后 24〜 3 6 小时用于生物学活性测定 。弃去培养瓶中的培养液，消化并收集细胞，用完全培养液 配 成 每 lm l含 5.0 * 10⁴〜 1.0 * 10⁵ 个 细 胞 的 细 胞 悬 液 ，接 种 于 9 6 孔细胞培养板中，每 孔 100ml，于 37°C 、 5 % 二氧化碳条件下培养。2 4 小时后换成维持培养液，于 37°C 、 5%二氧化碳条件下培养2 4 小时。制备的细胞培养板弃去维持液 ，加入标准品溶液和供试品溶液，每 孔 100ul，于 37°C 、5% 二氧化碳条件下培养64〜 7 2 小时。每 孔 加 入 M T T 溶液20^x1，于 37°C 、 5 % 二氧化碳条件下培养5 小时。以上步骤在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入二甲基亚砜100ul , 混匀后，放人酶标仪，以 630nm 为参比波 长 ，在 波 长 570nm处测定吸光度，记录测定结果。

试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理 ，并按下式计算结果：

供试品生物学活性（IU/ml) = Pr*(Ds*Es)/(Dr*Er)

式 中 Pr 为 标 准 品 生 物 学 活 性 ， IU/ml;

Ds 为供试品预稀释倍数；

Dr为标准品预稀释倍数；

Es 为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；

Er为标准品半 效 量 的 稀 释 倍 数 。

注 ：显色方法也可采用经等效验证的其他显色方法