关键词:抗体制备抗体标记重组蛋白表达

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重组蛋白纯化——GST融合蛋白柱上酶切

来源:重组蛋白部发布时间: 2019-05-29 06:50:56丨 520人浏览

融合标签的切割需要根据不同载体上设计的标签蛋白与目标蛋白之间的蛋白酶切位点选择合适的蛋白酶,福因德生物可以提供优质的蛋白酶。蛋白酶切需要注意的是目标蛋白内部不能有相同的蛋白酶切位点,酶切条件需要反复摸索,有些重组蛋白经蛋白酶切以后,由于理化性质发生了变化,有可能导致蛋白失活、发生沉淀或加速降解。

  1. 试剂准备

缓冲液A(平衡缓冲液):10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,140mM NaCl,2.7mM KCl,调节pH值至8.0

缓冲液B(洗脱缓冲液):10mM Glutathione(还原型),50mM Tris-HCl,调节pH值至8.0。因Glutathione易氧化,需现用现配

2.层析柱准备

2.1. 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头,确保柱底筛板上无气泡,关闭柱底出口,并在柱底部留出 1-2cm 的去离子水

2.2. 将GST亲和树脂悬浮,取2ml加入层析柱中,连接上恒流泵

2.3. 用5倍柱体积的缓冲液A进行平衡,使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,起到保护蛋白的作用

3.柱上酶切

3.1. 裂解菌体,充分离心后收集上清

3.2. 取上清加入层析柱,置于旋转培养器上,室温孵育1h,收集流出液,留样待检

3.3. 用5倍柱体积的缓冲液A进行清洗,去除非特异性吸附的杂蛋白,收集洗杂液,留样待检

3.4.向层析柱中添加适量3C酶,并添加适量体积的缓冲液A,室温下进行柱上酶切~3h

3.5. 分别收集流穿和3倍柱体积缓冲液B清洗的洗脱产物,SDS-PAGE分析结果

3.6. 取上一步骤得到的流穿于新的GST亲和树脂再次进行GST亲和层析,收集流穿,即为酶切后的目的蛋白组分

3.7. 将纯化过程中得到的样品(包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分等)以及原始样品使用SDS-PAGE 检测纯化及酶切效果

详细步骤可参照GST亲和层析介质使用说明书


酶切位点

切割位点

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